一种特异性高的果糖基肽氧化酶及其编码基因和用途制造技术

本发明专利技术涉及酶工程领域，公开了一种果糖基肽氧化酶及其编码基因，该果糖基肽氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术还公开了具有所述基因的重组载体及含有该重组载体的转化子。本发明专利技术还公开了所述果糖基肽氧化酶、基因、重组载体或转化子在酶法检测糖化血红蛋白中的应用。此外，本发明专利技术公开了一种增强果糖基肽氧化酶的特异性的方法，包括将来源于土正青霉的果糖基肽氧化酶的第62位精氨酸置换为另一种氨基酸，所述另一种氨基酸为赖氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸、亮氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸或脯氨酸。通过上述技术方案，本发明专利技术获得了酶活特异性明显提高的果糖基肽氧化酶，使得该酶更具有商业应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及酶工程领域，具体地，涉及一种果糖基肽氧化酶及其编码基因和用途。
技术介绍
糖尿病在中国属于高发病率慢性疾病，平均10个人就有一人是糖尿病患者。目前中国已成为全球糖尿病患病人数最多，患病率最高的国家。糖尿病严重危害到患者的健康，影响其生活质量，因此对糖尿病的治疗和监测十分重要。在人体红细胞120天生命周期内，血红蛋白可以持续被糖基化，而糖化血红蛋白形成的速率与血糖浓度成正比，因此糖化血红蛋白的含量反映了2-3个月血糖控制的情况。研究发现，与单纯的血糖水平相比，糖化血红蛋白的水平用于诊断糖尿病能更好地反映长期血糖控制和慢性并发症的风险，具有生物变异性较小、无需空腹采血等优点。临床上检测糖化血红蛋白的方法有很多，其中基于果糖基氨基酸氧化酶的酶法检测因具有操作简单、快速、价廉、精密度高等优点引起越来越多的关注。果糖基氨基酸氧化酶作为酶法检测糖化血红蛋白涉及的关键酶，是一类能水解果糖基氨基酸的酶。有些以α-果糖基氨基酸(例如α-果糖基缬氨酸(Fructosyl-aN-valine)，f-αVal)和ε-果糖基氨基酸(例如ε-果糖基赖氨酸(Fructosyl-εN-lysine)，f-εLys)为底物的果糖基氨基酸氧化酶对糖基化二肽或糖基化六肽具有活性，这类果糖基氨基酸氧化酶又被称为果糖基肽氧化酶，其由于既可以果糖基氨基酸为底物又可以果糖基二肽为底物，对检测糖化血红蛋白的前期处理的要求低，应用范围更广。然而，由于糖化白蛋白在蛋白酶的作用下分解释放出f-εLys，而f-εLys也可以作为果糖基肽氧化酶的底物，因此在全血检测糖化血红蛋白时，糖化白蛋白成为其最主要的干扰因素，这就要求用于糖化血红蛋白检测的果糖基肽氧化酶尽可能对f-εLys的酶活低。即，开发酶活特异性高(对f-αVal的专一性高且对f-αVal的比活力高于对f-εLys的比活力)的果糖基肽氧化酶更具有实际应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有果糖基肽氧化酶特异性不高的缺点，提供一种特异性高的酶突变体及其编码基因和相关用途。为了实现上述目的，本专利技术的专利技术人利用生物技术手段对来源于土正青霉(Eupenicilliumterrenum)的果糖基肽氧化酶进行了改造，发现第62位精氨酸是该酶与底物相互作用的关键位点，突变(置换)其第62位精氨酸即可有效改变其特异性，因此，第一方面，本专利技术提供了一种果糖基肽氧化酶，该果糖基肽氧化酶的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。第二方面，本专利技术提供了编码第一方面所述的果糖基肽氧化酶的基因。第三方面，本专利技术提供了具有第二方面所述的基因的重组载体。第四方面，本专利技术提供了含有第三方面所述的重组载体的转化子。第五方面，本专利技术提供了第一方面所述的果糖基肽氧化酶、第二方面所述的基因、第三方面所述的重组载体或第四方面所述的转化子在酶法检测糖化血红蛋白中的应用。第六方面，本专利技术提供了一种增强果糖基肽氧化酶的特异性的方法，该方法包括将来源于土正青霉的果糖基肽氧化酶的第62位精氨酸置换为另一种氨基酸，所述另一种氨基酸为赖氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸、亮氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸或脯氨酸。通过上述技术方案，本专利技术获得了酶活特异性明显提高的果糖基肽氧化酶，使得该酶更具有商业应用价值。本专利技术的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明附图是用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本专利技术，但并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为野生型果糖基肽氧化酶及本专利技术获得的果糖基肽氧化酶经纯化后的SDS-PAGE电泳图；图2为野生型果糖基肽氧化酶及本专利技术获得的果糖基肽氧化酶的特异性比较结果；图3为野生型果糖基肽氧化酶及本专利技术获得的果糖基肽氧化酶的比活力测定结果。具体实施方式以下对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。在本专利技术中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“酶活力”的大小即酶含量的多少，用酶活力单位表示，即酶单位(U)，本专利技术中酶单位的定义是：在37℃、pH8的条件下，每分钟产生1μmol氨基酸产物所需要的酶量定义为一个酶单位，即1U＝1μmol/min；“酶的比活力”代表每单位质量蛋白质的催化能力，能够反应酶活性大小，其值越大，表明酶活性越高，比活力的计算公式为：比活力(U/mg)＝总酶活力单位数/mg总蛋白；“特异性”是指果糖基肽氧化酶对某种底物(f-αVal或f-εLys)的专一性，特异性高主要指对f-αVal的专一性高且对f-αVal的比活力远高于对f-εLys的比活力；单位M＝mol/L，相应地，mM＝mmol/L，依此类推。组成蛋白质的20种氨基酸，按照侧链极性可以分成四类：1、非极性的氨基酸：丙氨酸(Ala，A)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、色氨酸(Trp，W)和脯氨酸(Pro，P)；2、极性不带电荷的氨基酸：甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、半胱氨酸(Cys，C)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酰胺(Gln，Q)和酪氨酸(Tyr，Y)；3、带正电荷的氨基酸：精氨酸(Arg，R)、赖氨酸(Lys，K)和组氨酸(His，H)；4、带负电荷的氨基酸：天冬氨酸(Asp，D)和谷氨酸(Glu，E)。本专利技术中使用的缩写“R62K”是指第62位的R残基突变为K残基，依此类推。第一方面，本专利技术提供的果糖基肽氧化酶的氨基酸序列如下面的SEQIDNO:1所示。MAHSRASTKVVVVGGGGTIGSSTALHLIRSGYTPSNITVLDVYKTPSLQSAGHDLNKIMGIXLRNGPDLQLSLESLDMWQNDELFKPFFHQVGMIDCSSSKEGIENLRRKYQTLLDAGIGLEKTNVWLESEDEILAKAPNFTREQVKGWKGLFCTDGGWLAAAKAINAIGIFLQDKGVKFGFGGAGTFQQPLFAADGKTCIGLETTDGTKYFADKVVLAAGAWSPTLVDLEDQCVSKAWVFAHIQLTPKEADAYKNVPVVYDGEYGFFFEPNEYGVIKVCDEFPGFSRFKLHQPYGAASPKMISVPRSHAKHPTDTYPDASEVTIRKAIARFLPEFKDKELFNRTMCWCTDTADANLLICEHPKWKNFILATGDSGHSFKLLPNIGKHVVELLEGSLSQEMAGAWRWRPGGDALRSRRGAPAKDLAEMPGWKHDAHL(SEQIDNO:1，其中X＝K、A、N、Q、F、V、I、H、L、S、M或P)优选地，SEQIDNO:1中的X为A、N、Q、V、I、H、L、S或M。更优选地，SEQIDNO:1中的X为N、Q、V、I、H、L或M。进一步优选地，SEQIDNO:1中的X为V、I、L或M。在特别优选的实施方式中，SEQIDNO:1中的X为N、Q、V、I或M，此时能够在提高酶活性的前提下进一步提高特异性。第二方面，本专利技术提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种果糖基肽氧化酶，其特征在于，该果糖基肽氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种果糖基肽氧化酶，其特征在于，该果糖基肽氧化酶的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.编码权利要求1所述的果糖基肽氧化酶的基因。3.一种重组载体，该重组载体具有权利要求2所述的基因。4.一种转化子，该转化子含有权利要求3所述的重组载体。5.权利要求1所述的果糖基肽氧化酶、权利要求2所述的基因、权利要求3所述的重组载体或权利要求4所述的转化子在酶法检测糖化血红蛋白中的应用。6.一种增强果糖基肽氧化酶的特异性的方法，其特征在于，该方法包括将来源于土正青霉(Eupenicilliumterrenum)的果糖基肽氧...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚为民，甘伟琼，刘海萍，邢克克，李亚峰，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12