用于从菜籽获得napin和cruciferin或它们的混合物的方法技术

本发明专利技术描述了用于从废菜籽中获得纯形式的菜籽蛋白napin和cruciferin的混合物、或单独蛋白的方法，其中在利用适宜的提取介质获得原始提取物之后，在限定pH水平下，在各种洗涤阶段，从所述原始提取物中洗出所期望的蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及从菜籽粗粉(rapeseedmeal)中来获得纯形式(inpureform)的菜籽蛋白napin和cruciferin的限定混合物，或分别获得单独蛋白质的方法，其中在利用适宜的提取介质获得原始提取物(rawextract)以后，通过多个纯化步骤，在限定的pH水平下，从原始提取物中纯化所期望的蛋白质。植物贮藏蛋白主要是球蛋白、很少的白蛋白。菜籽是最重要的植物，其种子中存在较大量的白蛋白。菜籽白蛋白被称为napin。菜籽球蛋白被称为cruciferin。天然地，在菜籽中存在约60％cruciferin和约20％napin。在许多应用领域商业上需要白蛋白。由于白蛋白在植物中的低丰度以及由于缺乏用于napin的工业纯化方法，所以至今没有植物来源的白蛋白可用于工业应用。菜籽蛋白是至今很少开发的可再生资源的储库(reservoir)。例如，在由菜籽的油生产过程中以及在其它农业过程中，它们大量地产生为副产物。主要地，它们是用作动物饲料的废物，因为借助于经济上和技术上适用的方法不能从其中获得纯的，从而技术上可用的组分。在菜籽中的两种主要贮藏蛋白，napin和cruciferin，其至今仅可以获得为粗品部分(crudefraction)，例如，基于它们的分离的组分的物理化学性能，有资格用于泡沫或胶水(glue)(napin)或有资格用于薄片(foil)的生产(cruciferin)。此外，它们还适用于食品行业，例如作为发泡剂或稳定剂。至今，主要地，沉淀和提取方法已用于在技术规模上获得粗蛋白部分或富集的化合物。在这种情况下，它是指美国专利4,370,267和4,368,151，其中描述了在等电沉淀以后通过在合适条件下的提取，植物来源的储存组分的富集。在WO2008/14439A1中描述了用于从菜籽植物中蛋白提取的另一种方法。在现代技术水平中的所有这些方法的特征在于低效率。此外，通过这种方式，不可能获得纯组分，而仅获得部分，以及主要地，仅优化这样的方法用于从蛋白质混合物中获得单一组分。至今仅通过复杂的实验室规模过程来获得更纯的物质，上述过程包括不同的纯化步骤的组合，例如，通过沉淀、透析、凝胶层析、和离子交换层析的组合来从菜籽中获得12S球蛋白。此外，导致蛋白分离物的方法是已知的，其组成随处理条件而变化并不允许获得限定的产物(WO2002/089597A1、WO2003/043438、WO2013/000066A1)。在这里，既未获得纯组分(napin/cruciferin)也未获得纯蛋白质混合物，而是获得仍然含有高水平的其它化合物的分离物。此外，在WO2002/05922中，描述了从菜籽蛋白中提取napin和cruciferin，其中通过“膨胀床(expandedbed)”阳离子交换层析，从水提取物中获得napin，以及通过“膨胀床”阴离子交换层析的运行来获得cruciferin。然而，通过这种描述的方法，不能从工业用原料以足够令人满意的纯度获得蛋白质。在WO2009/018660A1中已描述了一种类似的方法。其中提出了一种方法，借此，基本上一种纯的2S菜籽蛋白将获自菜籽粗粉。在约0.25至0.35M的盐浓度下，在约5至6的pH下，进行从油性盐溶液中菜籽蛋白的溶解。在阳离子交换柱上进行2S菜籽蛋白的纯化，然后通过利用盐浓度为0.55至0.7M的盐溶液从柱上分离蛋白质。这是非常高的盐浓度并且可以预期，在使用前，必须对产物加以脱盐。在2013年4月15-16日在Nuthetal(德国)的“植物蛋白(PlantProtein)”会议期间的公告上Hansen等已提出了用于菜籽蛋白混合物的另一种层析纯化方法。在Kristjansson等的出版物(AnnualTransactionsoftheNordicRheologySociety,Vol.21,p.317-320,2013)中描述了反应条件。在施加于两个柱以后，获得两个馏分，其中一个馏分含有具有较低分子量的蛋白质(napin)而另一个馏分则含有不同的可溶性菜籽蛋白的混合物。因此，本专利技术的技术问题主要是提供从菜籽植物中分别纯化菜籽蛋白napin和cruciferin或它们的混合物的方法，其避免在现代技术水平中描述的方法的缺点，即，其是工业上可扩展的，其以至少95％的纯度分别提供napin或cruciferin，或以至少50％的纯度分别提供混合物，以及其与商业上/工业上可用的菜籽产物相容如例如菜籽粗粉作为用于纯化的原料。通过提供如在专利权利要求中披露的实施方式，已实现针对此技术问题的解决方案。出人意外地，发现，通过根据本专利技术的方法，主要通过在单独的纯化步骤期间保持一定范围的pH值和盐浓度，可以高效率地将所期望的菜籽蛋白分离成纯化合物或分别地以高纯度加以分离。在根据本专利技术的方法中，在第一步骤中，简单地通过沉淀，可以获得高纯度的cruciferin(纯度高于95％)以及通过阳离子交换层析可以从上清液获得高纯度(纯度也高于95％)。根据本专利技术的方法还提供纯菜籽蛋白混合物，其具有约55-60％，优选约57％的napin，以及具有约40-45％，优选约43％的cruciferin。因此，本专利技术涉及用于从植物获得菜籽蛋白napin和/或cruciferin的混合物的方法，其中，所述方法包括以下步骤：(a)通过水提取来分解植物以获得原始提取物；(b)从步骤(a)的上清液获得所期望的蛋白质以及将上清液调节到在5.0至6.0的范围内的pH值；(c)通过阳离子交换器并借助于高盐洗脱缓冲液，分离来自步骤(b)的混合物，其中缓冲液的pH值是在5.0至6.0的范围内；以及(d)获得洗脱液。本专利技术还涉及用于从植物以纯形式来获得菜籽蛋白napin和/或cruciferin的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)通过水提取，来分解植物以获得原始提取物，优选pH为5.0-6.0；(b)从步骤(a)的上清液获得所期望的蛋白质并将上清液调节到在3.5至4.5的范围内的pH值；(c)离心和获得含有cruciferin的粒料(pellet)；(d)将来自步骤(c)的上清液调节到在7.0至8.0的范围内的pH值；(e)通过阳离子交换器并借助于pH值在7.0至8.0的范围内的高盐洗脱缓冲液来分离来自步骤(d)的混合物；以及(f)获得含有napin的洗脱液。优选地，根据本专利技术的方法并不包括进一步的步骤，即没有预处理步骤和/或进一步的纯化步骤，尤其是那些步骤(其基于所期望的蛋白质的特定物理化学特性，例如分子量、沉降系数、pI值是必要的)。然而，视情况而定，可以添加预处理和/或纯化步骤。相比与其中将蛋白质混合物施加于阳离子交换层析材料的方法，通过从步骤(a)的提取上清液沉淀cruciferin，阳离子交换层析的效率会严格增加。如在这里使用的，术语“纯形式(inpureform)”是指，蛋白质基本上不含杂质，优选具有至少95％的纯度，更优选至少98％，以及甚至更优选至少99％。为了获得蛋白质，可以使用植物的任何部分或组织，其中选择取决于在植物的单独部分或组织中所期望的蛋白质的不同浓度。优选地，所期望的蛋白质获自种子。用于分解菜籽植物的适当的方法是本领域技术人员已知的并且可以选择适用于分别本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从植物中获得菜籽蛋白napin和/或cruciferin的混合物的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)通过水提取来处理所述植物以获得原始提取物；(b)从来自步骤(a)的上清液中获得所期望的蛋白质以及将所述上清液调节至5.0至6.0的pH值；(c)在阳离子交换介质上借助于高盐洗脱缓冲液，分离来自步骤(b)的混合物，其中所述缓冲液的pH值是5.0至6.0；以及(d)获得洗脱液。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.12 DE 102014005466.71.一种用于从植物中获得菜籽蛋白napin和/或cruciferin的混合物的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)通过水提取来处理所述植物以获得原始提取物；(b)从来自步骤(a)的上清液中获得所期望的蛋白质以及将所述上清液调节至5.0至6.0的pH值；(c)在阳离子交换介质上借助于高盐洗脱缓冲液，分离来自步骤(b)的混合物，其中所述缓冲液的pH值是5.0至6.0；以及(d)获得洗脱液。2.一种用于从植物中获得纯形式的菜籽蛋白napin和/或cruciferin的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)通过水提取来处理所述植物以获得原始提取物；(b)从来自步骤(a)的上清液中获得所期望的蛋白质以及调节所述上清液至3.5至4.5的pH值；(c)离心和获得含有cruciferin的粒料；(d)将来自步骤(c)的上清液调节到7.0至8.0的pH值；(e)在阳离子交换介质上借助于pH值为7.0至8.0的高盐洗脱缓冲液来分离来自步骤(d)的混合物；以及(f)获得含有napin的洗脱液。3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(b)和(c)中的pH值是在5.5至6.0的范围内。4.根据权利要求2所述的方法，其中，在步骤(b)中pH值是在3.8...

【专利技术属性】
技术研发人员：克劳斯·杜林，拉尔夫彼得·特雷塞尔，芭芭拉·舒尔策，弗兰克·普德尔，
申请(专利权)人：皮洛特珀弗兰泽诺科技马格德堡公司PPMEV，克劳斯·杜林，
类型：发明
国别省市：德国;DE