塔格糖的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种塔格糖的制备方法，属于塔格糖的多酶催化制备领域。本发明专利技术以淀粉、纤维素或它们的衍生物或者以蔗糖为底物，在一个多酶反应体系中，通过体外多酶分子机器高效催化将底物高效转化为塔格糖。本发明专利技术通过添加能够促进淀粉、纤维素或蔗糖水解的酶以及利用副产物葡萄糖的酶，显著提升了原料的转化效率和塔格糖的产率。本发明专利技术方法制备塔格糖产率高、原料价廉、生产成本低，能够实现塔格糖的规模化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种塔格糖的制备方法，尤其涉及一种体外多酶催化将淀粉或纤维素及其衍生物转化为塔格糖的方法，属于塔格糖的酶催化制备领域。
技术介绍
塔格糖(D-Tagatose)是天然存在的一种稀有单糖，是半乳糖的酮糖形式，果糖的差向异构体。甜味特性与蔗糖相似，而产生的热量只为蔗糖的三分之一，所以被称之为低热量甜味剂。塔格糖具有低热量值、零血糖生成指数、血糖钝化作用、无龋齿性、益生元作用和抗氧化活性等优良营养特性。天然的塔格糖主要存在于酸乳、奶粉等乳制品中。塔格糖具有四大功能：低能量，降血糖，改善肠道菌群和抗龋齿(OhD-K:Tagatose:properties,applications,andbiotechnologicalprocesses.App.Microbiol.Biotechnol.2007,76:1-8)。生产塔格糖的方法有化学合成法和生物转化法两种。一般都以半乳糖为原料，通过化学方法或生物转化进行异构化反应而成。半乳糖原料可由乳糖水解得到，也有研究使用半乳糖醇为原料，经生物氧化为塔格糖。但半乳糖醇价格较高，目前暂不适宜用作工业化生产原料。化学合成法是利用可溶性碱金属盐或碱土金属盐为催化剂，促使D-半乳糖在碱性条件下生成塔格糖，并形成金属氢氧化物-塔格糖复合物，再用酸中和获得D-塔格糖。生物转化法包括将半乳糖醇氧化成塔格糖，和利用微生物所产生的异构酶将半乳糖异构成塔格糖两种方法。因化学法能耗高，产物复杂，纯化困难，副反应多，产生化学污染，故生物转化法具有较好的应用前景。目前研究较多的生物转化生产塔格糖的方法是利用L-阿拉伯糖异构酶催化D-半乳糖转化为塔格糖，然而半乳糖的较高价格影响了塔格糖的最终价格，导致无法广泛的使用(RhimiM,AghajariN,JuyM,ChouayekhH,MaguinE,HaserR,BejarS:RationaldesignofBacillusstearothermophilusUS100l-arabinoseisomerase:Potentialapplicationsford-tagatoseproduction.Biochim.2009,91:650-653.OhH-J,KimH-J,OhD-K:Increaseind-tagatoseProductionRatebySite-directedMutagenesisofl-arabinoseIsomerasefromGeobacillusthermodenitrificans.Biotechnol.Lett.2006,28:145-149.BosshartA,HeeCS,BechtoldM,SchirmerT,PankeS:DirectedDivergentEvolutionofaThermostableD-TagatoseEpimerasetowardsImprovedActivityforTwoHexoseSubstrates.ChemBioChem2015,16:592-601.MenY,ZhuY,ZhangL,KangZ,IzumoriK,SunY,MaY:EnzymaticconversionofD-galactosetoD-tagatose:Cloning,overexpressionandcharacterizationofl-arabinoseisomerasefromPediococcuspentosaceusPC-5.Microbiol.Res.2014,169:171-178.)。韩国科学家专利技术一种多酶催化的方法将果糖转化为塔格糖，包括利用6-磷酸塔格糖差向异构酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶将果糖转化为塔格糖(OhDK,HONGSH,LeeSH:Aldolase,aldolasemutantsandtagatoseusingthesameproductionmethodsandcompositionsforproduction.WO2015016544A1.GooglePatents；2015.)，但是从果糖生产6-磷酸果糖需要ATP对果糖进行底物磷酸化，导致塔格糖生产成本高，不适应大规模生产。因此，亟待开发一种低成本，低污染，高产率的适合规模化生产塔格糖的新方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种塔格糖的制备方法，该方法通过体外多酶催化淀粉或纤维素以及它们的衍生物，或者蔗糖制备塔格糖，具有塔格糖的产率和转化率高，生产成本低，无污染等优点。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术首先公开了一种淀粉塔格糖的制备方法，包括以下步骤：以淀粉或淀粉衍生物为底物，加入含有α-葡聚糖磷酸化酶(α-Glucanphosphorylase，EC2.4.1.1)、葡萄糖磷酸变位酶(Phosphoglucomutase，EC5.4.2.2)、葡萄糖磷酸异构酶(PhosphoglucoseIsomerase，EC5.3.1.9)、6-磷酸塔格糖差向异构酶(Tagatose6-phosphate4-epimerase)和6-磷酸塔格糖磷酸酶(Tagatose6-phosphatase)的多酶催化物建立多酶反应体系，进行酶催化反应，即得。为了达到更好的效果，优选的，将所得到酶催化反应产物按照常规的方法进行分离、纯化。所述多酶反应体系中，所述底物的浓度为1-500g/L，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量为0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸异构酶的用量为0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向异构酶的用量为0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量为0.1-1000U/mL；优选的，所述底物的浓度为100g/L，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量为10U/mL。所述酶催化反应的条件为：10-90℃反应1-100小时；优选为，37℃反应24-40小时。本专利技术淀粉塔格糖的制备方法中，所述淀粉优选为可溶性淀粉；所述淀粉衍生物包括：部分水解淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖或麦芽糖中的任意一种或多种按照任意比例组成的混合物。作为本专利技术的优选技术方案，所述多酶催化物中还包括(1)、(2)或(3)中任何一种：(1)淀粉去分支酶或麦芽糖磷酸化酶(maltosephosphorylase，EC2.4.1.8)中的任何一种或两种；(2)淀粉去分支酶或葡聚糖转移酶(4-a-glucanotransferase，EC.2.4.1.25)中的任何一种或两种；(3)淀粉去分支酶、麦芽糖磷酸化酶或葡聚糖转移酶中的任意一种或三种；优选的，在多酶反应体系中，所述淀粉去分支酶的用量为0.1-500U/mL，所述麦芽糖磷酸化酶或葡聚糖转移酶的用量为0.1-500U/mL；更优选的，所述淀粉去分支酶的用量为1U/mL，所述麦芽糖磷酸化酶或葡聚糖转移酶的用量为1U/mL；其中，所述淀粉去分支酶为异淀粉酶(isoamylase，EC3.2.1.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种塔格糖的制备方法，其特征在于，以淀粉或淀粉衍生物为底物，加入含有α‑葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6‑磷酸塔格糖差向异构酶、6‑磷酸塔格糖磷酸酶和无机磷酸根离子，建立多酶分子机器并进行多酶催化反应，即得塔格糖。

【技术特征摘要】
1.一种塔格糖的制备方法，其特征在于，以淀粉或淀粉衍生物为底物，加入含有α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶和无机磷酸根离子，建立多酶分子机器并进行多酶催化反应，即得塔格糖。2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述多酶反应体系中，所述底物的浓度为1-500g/L，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量为0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸异构酶的用量为0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向异构酶的用量为0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量为0.1-1000U/mL，所述无机磷酸根的浓度为2-100mM；优选的，所述底物的浓度为100g/L，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸变位酶的用量为10U/mL，所述葡萄糖磷酸异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向异构酶的用量为10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量为10U/mL，所述无机磷酸根的浓度为30mM。3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述酶催化反应的条件为：10-90℃反应1-100小时；优选为，37℃反应24-40小时。4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述淀粉衍生物包括部分水解淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖或麦芽糖中的任意一种或多种按照任意比例组成的混合物。5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述多酶催化物中还包括(1)、(2)或(3)中任何一种：(1)淀粉去分支酶或麦芽糖磷酸化酶中的任何一种或两种；(2)淀粉去分支酶或葡聚糖转移酶中的任何一种或两种；(3)淀粉去分支酶、麦芽糖磷酸化酶或葡聚糖转移酶中的任意一种或三种；优选的，在多酶反应体系中，所述淀粉去分支酶的用量为0.1-500U/mL，所述麦芽糖磷酸化酶的用量为0.1-500U/mL，所述葡聚糖转移酶的用量为0.1-500U/mL；更优选的，所述淀粉去分支酶的用量为1U/mL，所述麦芽糖磷酸化酶的用量为1U/mL，所述葡聚糖转移酶的用量为1U/mL；其中，所述淀粉去分支酶为异淀粉酶或普鲁兰酶中的任意一种或两种。6.按照权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于：所述多酶催化物中还包括：聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐；优选的，在多酶反应体系中，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量为0.1-500U/mL，所述聚磷酸盐的用量为1-100mM；更优选的，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量为1U/mL，所述聚磷酸盐的用量为10mM；其中，所述聚磷酸盐优选为聚磷酸钠。7.按照权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于：所述多酶催化物中还包括α淀粉酶；优选的，在多酶反应体系中，所述α淀粉酶的用量为0.01-100U/ml，更优选为0.1U/ml。8.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述多酶反应体系中还包括：缓冲液和二价镁离子；优选的，各成分的用量为：缓冲液10-500mM，二价镁离子1-50mM；其中，所述缓冲液为磷酸缓冲液，pH为5.0-9.0；优选的，pH为7.0；更优选的，各成分的用量为：磷酸缓冲液30mM，二价镁离子5mM。9.一种塔格糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以纤维素或纤维素衍生物为底物，加入含有纤维素酶、纤维多糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶，6-磷酸塔格糖磷酸酶和无机磷酸根的多酶催化物建立多酶反应体系，进行酶催化反应，即得塔格糖。10.按照权利要求9所述的制备方法，其特征在于：先将纤维素或纤维素衍生物和纤维素酶混合，离心，去上清，得到纤维素酶和纤维素的混合物；再加入纤维多糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶，6-磷酸塔格糖磷酸酶和无机磷酸根，建立多酶分子机器反应体系；其中，纤维素或纤维素衍生物的用量为1-500g/L、纤维素酶的用量为1-500U/ml；优选的，纤维素或纤维素衍生物的用量为100g/L，纤维素酶的用量为10U/ml。11.按照权利要求9或10所...

【专利技术属性】
技术研发人员：马延和，孙媛霞，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12