基于纳米模拟酶的可视化快速检测生物酶、蛋白质及其抑制剂的方法技术

本发明专利技术公开了一种含有纳米模拟酶的检测试剂。本发明专利技术还公开了基于纳米模拟酶技术对生物酶或者蛋白质及其抑制剂活性的可视化检测方法。该方法基于某些能够模拟天然氧化酶的纳米材料对许多显色剂的氧化反应呈现出良好的pH依赖性，以及许多天然酶或者蛋白质在发生生物催化的过程中能够释放/消耗H+的特性，利用反应体系pH的原位变化，影响该纳米材料的催化氧化能力，从而使检测试剂产生不同程度颜色变化，实现对生物酶或者蛋白质活性的可视化检测，并进而实现其对应抑制剂的可视化检测。本发明专利技术检测方法所输出的物理信号对待测体系中生物酶/蛋白质活性在一定浓度范围内呈现非常好的线性关系，从而实现对待测目标的高灵敏检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物分析领域，具体涉及基于纳米模拟酶的可视化快速检测生物酶、蛋白质及其抑制剂的方法。
技术介绍
生物体内一系列的生化反应中无不具有相应的生物酶的参与。正是这些具有高选择性、高催化活性的生物酶的调节，生物体才能完成复杂的高级生命活动。例如，乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)是中枢神经系统中非常重要的一种生物酶，能够催化脑内的乙酰胆碱水解生成醋酸和胆碱。研究表明，中枢神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性过低会导致乙酰胆碱的大量累积，从而造成器官损伤甚至死亡。而乙酰胆碱酯酶的活性如果过高，又会造成中枢神经系统内乙酰胆碱含量过低，容易引起阿尔茨海默病以及脑硬化。因此，检测乙酰胆碱酯酶在生理学上和医学上有着极为重要的意义。此外，有机磷类的农药是现代农业中常用的一种高毒性的农药试剂，它们虽然能够有效杀灭农业害虫，但是同样对人体有着剧烈的毒性，因此检测残留在果蔬中的有机磷类的农药对于人们健康极为重要。研究表明，有机磷类农药是乙酰胆碱酯酶的抑制剂，它们能够高效地抑制其活性，因此，对乙酰胆碱酯酶活性的检测也能被用于有机磷类农药的检测。除了能够产生H+的生物酶，还有一些酶能够在生物催化过程中消耗H+。例如脲酶(urease)，它通过催化尿素水解产生氨气和二氧化碳。在临床上，细菌导致的脲酶活性上升往往是许多疾病的发病机制，如肝炎、肝昏迷，感染性结石和消化性溃疡等。因此，检测脲酶的活性在临床上同样具有极为重要的生理意义。而脲酶的许多抑制剂多是具有环境毒性的物质，对人体健康亦有伤害，因此对脲酶活性的检测方法同样可以用于这些高毒性物质的检测。综上所述，对生物酶/蛋白质的检测不仅可以帮助人们对于从分子水平探索某些生理病理过程、信号传导过程以及某些疾病的发病机制，而且对于治疗相关疾病的药物研究和开发也极具指导和参考价值，也为某些具有环境毒性的物质的检测提供了新的方法和平台。传统检测生物酶/蛋白质活性的方法主要集中在高效液相色谱(Highperformanceliquidchromatography,HPLC)、毛细管电泳(Capillaryelectrophoresis，CE)、质谱(massspectrum)、荧光成像(Fluorescenceimaging,FI)等。然而这些经典方法在检测生物酶/蛋白质活性时存在许多不足之处。首先，这些方法大多需要昂贵而复杂的仪器，需要专业化的仪器操作员进行操作，因此难以实现现场分析。其次，生物样品需要复杂的前处理、预富集和分离等步骤，分析时间长，无法实现生物样品中待测物的快速分析，时间分辨率也较差。此外，生理环境异常复杂，许多生物酶/蛋白质在体内的浓度又很低，许多常规检测手段难以实现其快速测定。因此，十分需要发展一种新型的检测技术用于生物酶/蛋白质活性的快速、高灵敏、高选择性检测。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术针对目前一些生物酶/蛋白质活性检测方法存在的操作复杂、耗时长、灵敏度较差等现状，通过利用某些可以模拟天然酶活性的纳米材料，发展新原理实现对相关生物酶/蛋白质活性的快速、高选择性、高灵敏性检测。本专利技术提供了一种可以模拟天然氧化酶活性的纳米材料。该纳米材料可以像某些天然酶一样，无需额外的氧化剂(如过氧化氢等)直接利用氧气实现对某些常用显色剂的催化氧化，并产生颜色的变化。因此，我们也将该种纳米材料称之为纳米模拟酶。利用这类纳米模拟酶在模拟天然酶催化氧化显色剂时其催化能力对pH依赖的特性，通过待测生物酶/蛋白质催化底物反应过程中对检测试剂的pH值产生的变化，影响纳米模拟酶的催化活性，从而得到相应的输出信号，并通过合理的手段将这种输出信号读出，从而实现对待测物的分析。我们还发现在该检测过程中如果加入某些反应促进剂，可以加速显色反应的进行，并进一步提高检测的灵敏度，减低检测限。技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种含有纳米模拟酶的检测试剂，该检测试剂中包括有纳米材料、显色剂和反应促进剂。其中，上述纳米材料含有金属或金属氧化物中的一种或两种。其中，上述显色剂为具有氧化还原特性的化合物。其中，上述反应促进剂为含有高能磷酸键的生物分子，包括腺嘌呤核苷三磷酸，鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸、胸腺嘧啶核苷三磷酸、尿嘧啶核苷三磷酸和其类似物中的一种或几种，优选为ATP。一种基于纳米模拟酶的可视化快速检测生物酶、蛋白质活性的方法，包括以下步骤：1)纳米模拟酶的制备：利用湿法化学制备能够模拟天然酶的含有金属或金属氧化物的纳米材料，经分离、纯化并测定其浓度后备用；2)检测试剂缓冲液的制备：配制适合pH值及浓度的缓冲溶液待用；3)检测生物酶/蛋白质活性的检测试剂的制备：取一定量的显色剂、反应促进剂以及被测生物酶/蛋白质的反应底物加入到配制好的缓冲液中，混合均匀后待用；对于能够释放H+的生物酶/蛋白质，选用pH为7.0的磷酸缓冲液，而对于能够消耗H+的生物酶/蛋白质，则选用pH为4.5的磷酸缓冲液；4)生物酶/蛋白质活性的可视化检测：将上述检测试剂与含有待测检测生物酶/蛋白质的样品以及一定量的纳米模拟酶混合后在37℃下孵育反应，然后根据检测试剂颜色的变化或通过肉眼观察对待测生物酶/蛋白质的活性进行半定量的判断；或通过相应的仪器对待测生物酶/蛋白质的活性进行精确的测定和定量。其中，上述步骤2)中缓冲溶液为pH为7.0或4.5，浓度为5mM的磷酸缓冲溶液。其中，上述步骤3)中显色剂为3,3,5,5-四甲基联苯胺。其中，上述生物酶为乙酰胆碱酯酶和脲酶中的一种。其中，上述反应促进剂为ATP。一种基于纳米氧化酶可视化生物酶/蛋白质抑制剂活性的方法，所述方法包括步骤1)～3)，还包括步骤4)生物酶/蛋白质对应抑制剂的可视化检测：将已知活性的生物酶/蛋白质与对应的抑制剂混合后作用一段时间得到混合物，然后将该混合物与上述检测试剂以及一定量的纳米模拟酶混合后在37℃下孵育反应，最后根据检测试剂颜色的变化或通过肉眼观察对待测生物酶/蛋白质的抑制剂进行半定量的判断；或通过相应的仪器对待测生物酶/蛋白质的抑制剂进行精确的测定和定量。本专利技术的抑制剂为乙酰胆碱酯酶抑制剂甲基对氧膦和他克林以及脲酶抑制剂F-。本专利技术对待测生理活性小分子的定量检测原理：该纳米材料即纳米模拟酶可以利用氧气直接实现对显色剂的催化氧化，产生颜色的变化。但是该催化氧化的能力在一定pH范围内呈现出pH依赖的特性。一般而言，在pH偏中性时，催化能力较弱，产生的颜色较浅，而在pH偏酸性时，催化能力较强，产生的颜色较深。在某些反应促进剂如ATP的存在下，这种催化能力能够得到有效增强，因此催化反应时间可以大大缩短。利用该特性，通过待测生物酶/蛋白质在催化相应底物反应过程中对溶液pH值的影响，对所用纳米模拟酶活性原位进行调控，进行产生不同程度的颜色变化作为信号输出，最终实现待测生物酶/蛋白质及其抑制剂的分析。有益效果：本专利技术中该基于模拟天然酶的纳米模拟酶的检测方法所输出的物理信号对待测体系中生物酶/蛋白质活性在一定浓度范围内呈现非常好的线性关系，从而实现对待测目标的高灵敏检测。该检测体系几乎不受其他常见的生物酶/蛋白质的干扰，因此对目标待测物的检测有着高度选择性。此外该方法仪器简本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有纳米模拟酶的检测试剂，其特征在于，该检测试剂中包括有纳米材料、显色剂和反应促进剂。

【技术特征摘要】
1.一种含有纳米模拟酶的检测试剂，其特征在于，该检测试剂中包括有纳米材料、显色剂和反应促进剂。2.根据权利要求1所述的含有纳米模拟酶的检测试剂，其特征在于，该纳米材料含有金属或金属氧化物中的一种或两种。3.根据权利要求1所述的含有纳米模拟酶的检测试剂，其特征在于，所述显色剂为具有氧化还原特性的化合物。4.根据权利要求1所述的含有纳米模拟酶的检测试剂，其特征在于，所述反应促进剂为含有高能磷酸键的生物分子，包括腺嘌呤核苷三磷酸，鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸、胸腺嘧啶核苷三磷酸、尿嘧啶核苷三磷酸和其类似物中的一种或几种，优选为ATP。5.一种基于纳米模拟酶的可视化快速检测生物酶、蛋白质活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)纳米模拟酶的制备：利用湿法化学制备能够模拟天然酶的含有金属或金属氧化物的纳米材料，经分离、纯化并测定其浓度后备用；2)检测试剂缓冲液的制备：配制适合pH值及浓度的缓冲溶液待用；3)检测生物酶/蛋白质活性的检测试剂的制备：取一定量的显色剂、反应促进剂以及被测生物酶/蛋白质的反应底物加入到配制好的缓冲液中，混合均匀后待用；4)生物酶/蛋白质活性的可视化检测：将上述检测试剂与含有待测检测生物酶/蛋白质的样品以及一定量的纳米模拟酶混合后在37℃下孵育反应，然后根据检测试剂颜色的变化或通过肉眼观察对待测生物酶/蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏辉，程翰俊，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32