一种维生素A脂肪酸酯合成用固定化脂肪酶的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种维生素A脂肪酸酯合成用固定化脂肪酶的制备方法，涉及生物酶催化剂技术领域，包括如下步骤：(1)共固定剂的制备，(2)载体的制备，(3)活化载体的制备，(4)固定化脂肪酶的制备。本发明专利技术所制固定化脂肪酶能显著提高维生素A脂肪酸酯的收率，尤其将由维生素A醋酸酯制备维生素A棕榈酸酯的收率提高到94％以上，且经粗分离后的维生素A棕榈酸酯纯度达到99％以上。

Method for preparing immobilized lipase for synthesizing vitamin A fatty acid ester

The invention discloses a vitamin A fatty acid ester synthesis method for preparing immobilized lipase, relates to the technical field of biological enzyme catalyst, which comprises the following steps: (1) total fixed agent preparation, preparation of carrier (2), (3) activated carrier preparation, immobilized lipase (4) the preparation of. The immobilized lipase can significantly improve the yield of vitamin A fatty acid ester, especially by vitamin A acetate preparation of vitamin A palmitate was increased to more than 94%, and the purity of crude vitamin A palmitate after separation of more than 99%.

【技术实现步骤摘要】
一种维生素A脂肪酸酯合成用固定化脂肪酶的制备方法
：本专利技术涉及生物酶催化剂
，具体涉及一种维生素A脂肪酸酯合成用固定化脂肪酶的制备方法。
技术介绍
：维生素A脂肪酸酯是人体正常代谢所不可缺少的一种物质，它能维持和促进人体生长、发育、生殖和细胞膜的稳定性，对视觉的形成有明显的作用。而且，维生素A脂肪酸酯还有助于细胞的繁殖和区分坏死细胞，并且作为一种抗氧化剂能与那些可以产生基因突变的自由基结合。目前，常采用化学法生产维生素A脂肪酸酯，使用催化剂甲醇钠、Grignard试剂等并在高温高压条件下进行催化反应。虽然收率不错，但存在许多难以克服的缺点，如催化剂有毒性、高温高压反应能耗高、副反应多、分离和精制困难等。因此，近年来人们开始利用酶催化法制备维生素A脂肪酸酯。专利CN1621528A公开了一种用固定化脂肪酶催化合成维生素A脂肪酸酯的方法，其说明书实施例中报道的原料转化率最高为85％，最低为51％，由于未公开维生素A脂肪酸酯的收率，而原料在反应过程中会生成副产物，因此维生素A脂肪酸酯收率远低于85％。而在此反应中固定化脂肪酶的催化活性十分关键，直接决定原料的转化率和产物收率，因此目前仍需致力于开发高活性且易回收再利用的固定化脂肪酶。
技术实现思路
：本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种催化活性强、收率高且绿色环保的维生素A脂肪酸酯合成用固定化脂肪酶的制备方法。本专利技术所要解决的技术问题采用以下的技术方案来实现：一种维生素A脂肪酸酯合成用固定化脂肪酶的制备方法，包括如下步骤：(1)共固定剂的制备：向泊洛沙姆中加入交联聚维酮和六羟甲基三聚氰胺六甲醚，并以5℃/min的升温速度升温至70-75℃保温混合15min，然后加入阴离子聚丙烯酰胺和环氧大豆油，继续以5℃/min的升温速度升温至115-120℃保温混合30min，所得混合物转入5-10℃环境中密封静置1h，并再次以5℃/min的升温速度升温至110-115℃保温混合30min，再加入50-55℃水，充分混合后于50-55℃保温静置1h，过滤，所得滤渣送入冷冻干燥机中，干燥后所得固体经超微粉碎机制成微粉，即得共固定剂；(2)载体的制备：向水中加入陶瓷微粉、羟丙基甲基纤维素和葡萄糖酸钠，以5℃/min的升温速度升温至回流状态保温混合15min，过滤，所得滤渣水洗三次，并将滤渣加入滚筒式混合机中；同时将纳米二氧化钛和纳米胶粉加入乙醇中，以5℃/min的升温速度升温至回流状态保温混合30min，所得混合液以喷雾方式均匀喷向滤渣表面，然后自然冷却至室温，所得固体于40-45℃下真空干燥，最后于400-450℃下焙烧2h，即得载体；(3)活化载体的制备：将上述所制载体和共固定剂于45-50℃下充分混合，静置30min后加入水解聚马来酸酐，混合均匀，即得活化载体；(4)固定化脂肪酶的制备：将酵母类脂肪酶的水溶液按5000单位/克活化载体的比例与活化载体混合，于35℃下振荡24h，振荡过程中分3-5次加入过氧化氢脲，最后离心，经室温晾干后即得固定化脂肪酶。所述步骤(1)中泊洛沙姆、交联聚维酮、六羟甲基三聚氰胺六甲醚、阴离子聚丙烯酰胺、环氧大豆油和水的质量比为15-20:5-10:0.5-1:3-5:0.5-1:50-100。所述步骤(2)中水、陶瓷微粉、羟丙基甲基纤维素、葡萄糖酸钠、纳米二氧化钛、纳米胶粉和乙醇的质量比为50-100:20-25:3-5:0.5-1:5-10:0.5-1:30-40。所述步骤(3)中载体、共固定剂和水解聚马来酸酐的质量比为1:1:0.05。所述步骤(4)中酵母类脂肪酶的水溶液按10000单位/克过氧化氢脲的比例加入过氧化氢脲。所述步骤(1)中泊洛沙姆使用前经过预处理，其具体预处理方法为：向泊洛沙姆中加入乳酸和田菁粉，充分混合后于微波频率2450MHz、输出功率700W下微波处理5min，室温静置30min后再次微波处理5min，再加入30-35℃水，搅拌30min后送入喷雾干燥机中，干燥所得颗粒经超微粉碎机制成微粉。所述泊洛沙姆、乳酸、田菁粉和水的质量比为15-20:0.5-1:0.1-0.2:50-100。所述步骤(2)中纳米二氧化钛是由二氧化钛经改性后制成的纳米粉体，其制备方法为：向二氧化钛中加入聚氧化乙烯和N-羟甲基丙烯酰胺，先以5℃/min的升温速度升温至120-125℃保温混合30min，再加入萜烯树脂和聚二甲基二烯丙基氯化铵，继续在120-125℃下保温混合30min，所得混合物以5℃/min的降温速度降温至45-50℃，并加入45-50℃水，再以10℃/min的升温速度升温至回流状态保温混合10min，经自然冷却至45-50℃后静置1h，过滤，所得固体于75-80℃下烘干，最后送入纳米研磨机中，经研磨得到纳米二氧化钛。所述二氧化钛、聚氧化乙烯、N-羟甲基丙烯酰胺、萜烯树脂、聚二甲基二烯丙基氯化铵和水的质量比为30-40:3-5:0.5-1:2-3:0.1-0.3:100-150。本专利技术的有益效果是：(1)泊洛沙姆经预处理后降低其水溶性，增强其亲脂性，促进其与共固定剂其他制备原料的共混相容，以制得性能优异的共固定剂；(2)所制纳米二氧化钛不同于市售的纳米二氧化钛，其不仅具有优异的表面吸附活性，而且渗透性和抗腐蚀性好，从而以包含于陶瓷微粉内部和包覆于陶瓷微粉外部的方式来协同陶瓷微粉作为载体；(3)利用羟丙基甲基纤维素和葡萄糖酸钠对陶瓷微粉进行预处理，增强其表面活性和畅通其内部孔道；(4)通过水解聚马来酸酐与共固定剂的协同使用，增强脂肪酶在载体上的牢固固定；(5)以过氧化氢脲作为脂肪酶的氧源，保证脂肪酶的催化活性，并实现脂肪酶的循环利用；(6)所制固定化脂肪酶能显著提高维生素A脂肪酸酯的收率，尤其将由维生素A醋酸酯制备维生素A棕榈酸酯的收率提高到94％以上，且经粗分离后的维生素A棕榈酸酯纯度达到99％以上。具体实施方式：为了使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。实施例1(1)共固定剂的制备：向15份泊洛沙姆中加入5份交联聚维酮和0.5份六羟甲基三聚氰胺六甲醚，并以5℃/min的升温速度升温至70-75℃保温混合15min，然后加入5份阴离子聚丙烯酰胺和0.5份环氧大豆油，继续以5℃/min的升温速度升温至115-120℃保温混合30min，所得混合物转入5-10℃环境中密封静置1h，并再次以5℃/min的升温速度升温至110-115℃保温混合30min，再加入100份50-55℃水，充分混合后于50-55℃保温静置1h，过滤，所得滤渣送入冷冻干燥机中，干燥后所得固体经超微粉碎机制成微粉，即得共固定剂；(2)载体的制备：向100份水中加入20份陶瓷微粉、3份羟丙基甲基纤维素和0.5份葡萄糖酸钠，以5℃/min的升温速度升温至回流状态保温混合15min，过滤，所得滤渣水洗三次，并将滤渣加入滚筒式混合机中；同时将5份纳米二氧化钛和0.5份纳米胶粉加入40份乙醇中，以5℃/min的升温速度升温至回流状态保温混合30min，所得混合液以喷雾方式均匀喷向滤渣表面，然后自然冷却至室温，所得固体于40-45℃下真空干燥，最后于400-450℃下焙烧2h，即得载体；(3)活化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种维生素A脂肪酸酯合成用固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)共固定剂的制备：向泊洛沙姆中加入交联聚维酮和六羟甲基三聚氰胺六甲醚，并以5℃/min的升温速度升温至70‑75℃保温混合15min，然后加入阴离子聚丙烯酰胺和环氧大豆油，继续以5℃/min的升温速度升温至115‑120℃保温混合30min，所得混合物转入5‑10℃环境中密封静置1h，并再次以5℃/min的升温速度升温至110‑115℃保温混合30min，再加入50‑55℃水，充分混合后于50‑55℃保温静置1h，过滤，所得滤渣送入冷冻干燥机中，干燥后所得固体经超微粉碎机制成微粉，即得共固定剂；(2)载体的制备：向水中加入陶瓷微粉、羟丙基甲基纤维素和葡萄糖酸钠，以5℃/min的升温速度升温至回流状态保温混合15min，过滤，所得滤渣水洗三次，并将滤渣加入滚筒式混合机中；同时将纳米二氧化钛和纳米胶粉加入乙醇中，以5℃/min的升温速度升温至回流状态保温混合30min，所得混合液以喷雾方式均匀喷向滤渣表面，然后自然冷却至室温，所得固体于40‑45℃下真空干燥，最后于400‑450℃下焙烧2h，即得载体；(3)活化载体的制备：将上述所制载体和共固定剂于45‑50℃下充分混合，静置30min后加入水解聚马来酸酐，混合均匀，即得活化载体；(4)固定化脂肪酶的制备：将酵母类脂肪酶的水溶液按5000单位/克活化载体的比例与活化载体混合，于35℃下振荡24h，振荡过程中分3‑5次加入过氧化氢脲，最后离心，经室温晾干后即得固定化脂肪酶。...

【技术特征摘要】
1.一种维生素A脂肪酸酯合成用固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)共固定剂的制备：向泊洛沙姆中加入交联聚维酮和六羟甲基三聚氰胺六甲醚，并以5℃/min的升温速度升温至70-75℃保温混合15min，然后加入阴离子聚丙烯酰胺和环氧大豆油，继续以5℃/min的升温速度升温至115-120℃保温混合30min，所得混合物转入5-10℃环境中密封静置1h，并再次以5℃/min的升温速度升温至110-115℃保温混合30min，再加入50-55℃水，充分混合后于50-55℃保温静置1h，过滤，所得滤渣送入冷冻干燥机中，干燥后所得固体经超微粉碎机制成微粉，即得共固定剂；(2)载体的制备：向水中加入陶瓷微粉、羟丙基甲基纤维素和葡萄糖酸钠，以5℃/min的升温速度升温至回流状态保温混合15min，过滤，所得滤渣水洗三次，并将滤渣加入滚筒式混合机中；同时将纳米二氧化钛和纳米胶粉加入乙醇中，以5℃/min的升温速度升温至回流状态保温混合30min，所得混合液以喷雾方式均匀喷向滤渣表面，然后自然冷却至室温，所得固体于40-45℃下真空干燥，最后于400-450℃下焙烧2h，即得载体；(3)活化载体的制备：将上述所制载体和共固定剂于45-50℃下充分混合，静置30min后加入水解聚马来酸酐，混合均匀，即得活化载体；(4)固定化脂肪酶的制备：将酵母类脂肪酶的水溶液按5000单位/克活化载体的比例与活化载体混合，于35℃下振荡24h，振荡过程中分3-5次加入过氧化氢脲，最后离心，经室温晾干后即得固定化脂肪酶。2.根据权利要求1所述的维生素A脂肪酸酯合成用固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中泊洛沙姆、交联聚维酮、六羟甲基三聚氰胺六甲醚、阴离子聚丙烯酰胺、环氧大豆油和水的质量比为15-20:5-10:0.5-1:3-5:0.5-1:50-100。3.根据权利要求1所述的维生素A脂肪酸酯合成用固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中水、陶瓷微粉、羟丙基甲基纤维素、葡萄糖酸钠、纳米二氧化钛、纳米胶粉和乙醇的质量比为50-100:20-25:3-5...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫磊，桂金秋，孙凯，梁军，王妍，蔡克瑞，刘春玲，齐悦，晁岳刚，孙晓冬，
申请(专利权)人：牡丹江医学院，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23