25‑羟基维生素D3荧光免疫层析用活化荧光乳胶微球制造技术

本发明专利技术公开了一种25‑羟基维生素D3荧光免疫层析检测卡用活化荧光乳胶微球及检测卡。本发明专利技术的25‑羟基维生素D3荧光免疫层析检测卡用活化荧光乳胶微球的制备方法，包括如下步骤：1）取表面活性剂加入pH为8~10的缓冲溶液中，再加入二甲基甲酰胺、N,N’‑二环己基碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺；2）取氨基表面的荧光乳胶微球的分散液，以缓冲溶液调pH至8~10后，加入到步骤1）所得的混合物中，搅拌反应，反应完毕后，离心去除上清液，得到表面活化的荧光乳胶微球；其中，所述表面活性剂含有聚乙二醇单月桂酸酯、十二烷基苯磺酸盐和月桂酰谷氨酸盐，三者的重量比为2~10:0.5~2:3~7。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于荧光免疫层析
，具体涉及一种25-羟基维生素D3荧光免疫层析检测卡用的活化荧光乳胶微球及其制备和应用。
技术介绍
荧光免疫层析检测卡（试剂卡）因其快速便捷的特性，广泛用于快检领域。待测物抗体标记荧光乳胶微球，乳胶微球在液相中存在着表面电子斥力和范德华力使得液相中的乳胶颗粒保持均匀分布。但是喷涂于玻璃纤维素膜并烘干后随着溶液被蒸发干，表面张力推动乳胶颗粒间无限靠近导致分子间斥力消失，范德华力增大，最终使得多个乳胶分子团聚成大大小小不同的颗粒。当免疫层析时加入样本复溶乳胶微球时，乳胶微球不再均匀分散导致层析失败。因此本领域多采用荧光免疫层析试剂盒，含检测卡加上样本缓冲液。增加了检测复杂度。或者由于乳胶微球部分凝聚，使得检测灵敏度降低，检测结果出现假阴性。另外，乳胶微球的不稳定，也会使得荧光检测卡的稳定性差，不便于保存以及运输。维生素D的两个最重要的形式是维生素D3（胆钙化甾醇）和维生素D2（麦角钙化甾醇）。在人体内，维生素D3和D2与血浆中维生素D结合蛋白结合，并转运到肝脏，两者经25羟基化成为25羟基维生素D，血清中检测出来的95％以上的25羟基维生素D为25羟基维生素D3，维生素D缺乏是继发性甲状旁腺机能亢进症的常见病因。提高甲状旁腺激素含量，特别是提高缺乏维生素D的老年人的甲状旁腺激素含量会导致骨软化症，增加了骨转化，降低了骨质量，并有骨折的危险。25－羟基维生素D3含量低还与骨密度低有关。与其他临床数据结合，其结果可作为辅助手段来判定骨代谢。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：荧光免疫层析检测卡的荧光乳胶微球在烘干后，容易团聚，分散不均匀，从而导致层析失败或使得检测灵敏度降低。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种25-羟基维生素D3荧光免疫层析检测卡用的活化荧光乳胶微球及其制备，应用该活化荧光乳胶微球制备的25-羟基维生素D3干式荧光免疫层析检测卡，本检测卡可用于体外定量测定人血清、血浆或全血中25－羟基维生素D3的含量。本专利技术的检测卡可以解决荧光乳胶微球在喷涂、烘干玻璃纤维素膜时发生团聚的现象，以便制备标记物垫，从而得到干式荧光免疫层析检测卡，无需稀释液配置检测试剂盒。本专利技术提供的25-羟基维生素D3荧光免疫层析检测卡用活化荧光乳胶微球的制备方法，包括如下步骤：1）取表面活性剂加入pH为8~10的缓冲溶液中，再加入二甲基甲酰胺、N,N’-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺；2）取氨基表面的荧光乳胶微球的分散液，以缓冲溶液调pH至8~10后，加入到步骤1）所得的混合物中，搅拌反应，反应完毕后，离心去除上清液，得到活化荧光乳胶微球；其中，所述表面活性剂含有聚乙二醇单月桂酸酯、十二烷基苯磺酸盐和月桂酰谷氨酸盐，三者的重量比为2~10:0.5~2:3~7。优选地，所述表面活性剂为聚乙二醇单月桂酸酯、十二烷基苯磺酸钠和月桂酰谷氨酸钠重量比为5:1:4的混合物。优选地，所述表面活性剂与所述氨基表面的荧光乳胶微球的质量比为500~2000:1。优选地，步骤1）和步骤2）中所述的缓冲溶液为碳酸缓冲液；步骤2）中的搅拌反应时间为2~4小时，温度为20~30℃；氨基表面的荧光乳胶微球为氨基聚苯乙烯荧光微球。本专利技术还提供上述的制备方法得到的25-羟基维生素D3荧光免疫层析检测卡用活化荧光乳胶微球。本专利技术还提供上述的25-羟基维生素D3荧光免疫层析检测卡用活化荧光乳胶微球的标记物工作液的制备方法：取25-羟基维生素D3荧光免疫层析检测卡用活化荧光乳胶微球分散于微球缓冲液中，得到标记物工作液；表面活化的荧光乳胶微球在标记物工作液中所占的比例为0.5~2wt%；其中，微球缓冲液的制备方法为：将BSA、生物防腐剂、雷米邦A和甜菜碱溶于0.01M、pH7.4的磷酸缓冲液中。优选地，BSA、生物防腐剂、雷米邦A和甜菜碱在所述微球缓冲液中的浓度均为0.1wt%。本专利技术还提供25-羟基维生素D3荧光免疫层析检测卡的标记物垫的制备方法，包括如下步骤:1）活化荧光乳胶微球标记的兔IgG的制备：取上述制备方法得到的标记物工作液，离心，弃上清液后，用标记缓冲液复溶，并且同时加入碳二亚胺和兔IgG，搅拌反应，然后离心，弃上清液，最后用标记稀释液复溶；2）活化荧光乳胶微球标记的标记用鼠抗人25-羟基维生素D3单克隆抗体的制备方法：取上述制备方法得到的标记物工作液，离心，弃上清液后用标记缓冲液复溶，并且同时加入碳二亚胺和标记用鼠抗人25-羟基维生素D3单克隆抗体，搅拌反应，然后离心，弃上清液，最后用标记稀释液复溶；3）取步骤1）所得分散液和步骤2）所得分散液，混合，喷涂于玻璃纤维之上，烘干；所述标记缓冲液的配方为：碳酸钠4.33g、碳酸氢钠2.96g，溶于1000mL水中；所述标记稀释液的配方为：柠檬酸三钠7.33g、柠檬酸4.44g、氢氧化钠1g，溶于1000mL水中。其中，活化荧光乳胶微球标记的标记用鼠抗人25-羟基维生素D3单克隆抗体与活化荧光乳胶微球标记的兔IgG的体积比为1:1~3:1，优选为2:1。本专利技术提供一种25-羟基维生素D3荧光免疫层析检测卡，包括：上述的标记物垫、包被垫和吸收垫，其中所述标记物垫搭接于包被垫的一端上，吸收垫搭接于包被垫的另一端上，包被垫上设有质控线和检测线，质控线上包被有羊抗兔IgG的抗体，检测线上包被有25-羟基维生素D3完全抗原。本专利技术能够达到如下技术效果：1、本专利技术研究发现经特定的表面活性剂活化的荧光乳胶微球在烘干时保持颗粒间的相对距离不易团聚。层析过程时，加入样本能即刻复溶并顺利层析，以便制备干式荧光免疫层析检测卡（试剂卡），方便用户使用，且检测结果稳定、准确、可靠。2、本专利技术通过实验筛选出适合用于25-羟基维生素D3荧光免疫层析检测卡的荧光乳胶微球的特定表面活性剂组合。采用特定的表面活性剂事先处理化学修饰的荧光乳胶微球，处理后的乳胶微球标记25-羟基维生素D3抗体，用于制备25-羟基维生素D3荧光免疫层析检测卡的标记物垫，实现乳胶微球均匀喷涂，无团聚现象。并且，在加入待测样本后，标记的荧光乳胶微球可以快速的、顺利实现层析，无需特殊样本稀释液或者缓冲液处理检测卡。3、本专利技术所制备的25-羟基维生素D3干式荧光免疫层析检测卡，稳定性强，操作简便，用户友好，检测结果准确、可靠，灵敏度高。附图说明图1是本专利技术的25-羟基维生素D3荧光免疫层析试剂卡的截面分解结构示意图。图2是本专利技术的25-羟基维生素D3荧光免疫层析试剂卡的俯视结构示意图。图325-羟基维生素D3(25-OH-D3)标准曲线的建立。图4全血样本中25-羟基维生素D3(25-OH-D3)含量测定曲线。图5是实施例5的检测卡的荧光信号曲线。图6是实施例6的检测卡的荧光信号曲线。图7是实施例7的检测卡的荧光信号曲线。图8是实施例8的检测卡的荧光信号曲线图9是对比例的检测卡的荧光信号曲线。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。本专利技术提供了一种25-羟基维生素D3荧光免疫层析检测卡用活化荧光乳胶微球，包括如下步骤：1）取表面活性剂加入pH为8~10的缓冲溶液中，加入二甲基甲酰胺、N,N’-二环己基碳二亚胺和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种25‑羟基维生素D3荧光免疫层析检测卡用活化荧光乳胶微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1）取表面活性剂加入pH为8~10的缓冲溶液中，再加入二甲基甲酰胺、N,N’‑二环己基碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺；2）取氨基表面的荧光乳胶微球的分散液，以缓冲溶液调pH至8~10后，加入到步骤1）所得的混合物中，搅拌反应，反应完毕后，离心去除上清液，得到活化荧光乳胶微球；其中，所述表面活性剂含有聚乙二醇单月桂酸酯、十二烷基苯磺酸盐和月桂酰谷氨酸盐，三者的重量比为2~10:0.5~2:3~7。

【技术特征摘要】
1.一种25-羟基维生素D3荧光免疫层析检测卡用活化荧光乳胶微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1）取表面活性剂加入pH为8~10的缓冲溶液中，再加入二甲基甲酰胺、N,N’-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺；2）取氨基表面的荧光乳胶微球的分散液，以缓冲溶液调pH至8~10后，加入到步骤1）所得的混合物中，搅拌反应，反应完毕后，离心去除上清液，得到活化荧光乳胶微球；其中，所述表面活性剂含有聚乙二醇单月桂酸酯、十二烷基苯磺酸盐和月桂酰谷氨酸盐，三者的重量比为2~10:0.5~2:3~7。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂为聚乙二醇单月桂酸酯、十二烷基苯磺酸钠和月桂酰谷氨酸钠重量比为5:1:4的混合物。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂与所述氨基表面的荧光乳胶微球的重量比为500~2000:1。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1）和步骤2）中所述的缓冲溶液为碳酸缓冲液；步骤2）中的搅拌反应时间为2~4小时，温度为20~30℃；氨基表面的荧光乳胶微球为氨基聚苯乙烯荧光微球。5.权利要求1~4任一项所述的制备方法得到的25-羟基维生素D3荧光免疫层析检测卡用活化荧光乳胶微球。6.权利要求5所述的25-羟基维生素D3荧光免疫层析检测卡用活化荧光乳胶微球的标记物工作液的制备方法，其特征在于，取25-羟基维生素D3荧光免疫层析检测卡用活化荧光乳胶微球分散于微球缓冲液中，得到标记物工作液；表面活化的荧光乳胶微球在标记物工作液中所占的比例为0.5~2wt%；其中，微球缓冲液的制备方法为：将BSA、生物防腐剂、雷米邦A和甜菜碱溶于0.01M、pH7.4的...

【专利技术属性】
技术研发人员：林斯，
申请(专利权)人：北京华科泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11