检测脂多糖的比色传感器、其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种检测脂多糖的比色传感器、其制备方法和应用，传感器通过紫外‑可见光谱技术进行检测，其特征在于利用了氨基苯硼酸修饰的磁纳米颗粒对脂多糖的识别及其类似于过氧化物酶的催化氧化活性和脂多糖类脂质双层对离子运输的阻碍作用。本发明专利技术利用了3‑氨基苯硼酸与脂多糖的高特异性结合及脂多糖类脂质双层对离子运输的阻碍作用，保证了检测的高度特异性，借助磁纳米颗粒类似于过氧化物酶的催化氧化活性，提高了检测的灵敏性。通过紫外‑可见光谱技术捕捉磁纳米催化H2O2氧化ABTS产生的颜色变化，实现了脂多糖的分析检测。本发明专利技术方法简单、快速、无需信号标记；灵敏度高，可以在0.00001 μg/mL到180 μg/mL范围内线性检测脂多糖；特异性强，可以有效地区分脂多糖与其他对照物质。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种食品卫生质量检测工艺设备、方法和应用，特别是涉及一种细菌内毒素检测仪器、方法和应用，应用于食品质量控制和保健管理分析

技术介绍
脂多糖（LPS）是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后释放出来，故称内毒素。内毒素由三部分组成：类脂A、核心寡聚糖和特异性O-抗原多糖侧链，其毒性成分主要为类脂质A。脂质A为构成内毒素毒性的糖脂，以共价键连接到杂多糖链。内毒素位于细胞壁的最外层，覆盖于细胞壁的黏肽上，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等。当食物灭菌后，微生物水平往往能够满足卫生标准要求，因此微生物水平无法反映食品加工生产过程的卫生质量。但内毒素水平经灭菌后则不会变化，故其能够很好地显示食品加工生产的卫生水平，从而服务于食品卫生安全质量的控制。因此，检测食品的脂多糖水平具有重要意义。目前，检测脂多糖的方法有鲎试剂法、酶联免疫检测法、快速银染法等。鲎试剂检测法操作简单易行，检查内毒素特异性强、灵敏度高，但其假阳性反应较多。酶联免疫法比较简单经济，可在适当的浊度范围内进行半定量测定，其缺陷为特异性不强。快速银染法具有耗时长、操作繁琐、精密度和定量性较差等特点。这些方法均难以满足日常快速分析的要求。由此可见，建立内毒素的分析新方法和研发毒素检测装置成为亟待解决的技术问题。
技术实现思路
为了解决现有技术问题，本专利技术的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种检测脂多糖的比色传感器、其制备方法和应用，能高效、灵敏、快速检测脂多糖，应用前景优异，测得数据准确可靠。本专利技术将磁纳米颗粒的类过氧化物酶活性与脂多糖的类脂质双层结构调节的离子运输相结合，利用3-氨基苯硼酸与脂多糖的识别作用，采用紫外-可见分光光谱作为检测手段，实现了对脂多糖的高灵敏、高特异性分析检测的目的。为达到上述专利技术创造目的，本专利技术采用如下专利技术构思：本专利技术利用脂多糖的类脂质双层结构调节的离子运输和3-氨基苯硼酸对脂多糖的识别作用实现了对脂多糖的特异性和灵敏性的检测。本专利技术所采用的机理如下：选用3-氨基苯硼酸作为脂多糖的识别元件，通过3-氨基苯硼酸中氨基基团与磁纳米颗粒表面的羧基基团反应形成的酰胺键将小分子3-氨基苯硼酸修饰到磁纳米颗粒上，得到表面覆盖硼酸识别基团的磁纳米颗粒。由于磁纳米颗粒具有类似过氧化氢酶的性质，在酸性条件和过氧化氢（H2O2）存在的条件下，催化2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）氧化为2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基（ABTS.-），在特定波长处出现高的吸收峰，上清液呈现出较深的绿色。当有脂多糖存在的条件下，磁纳米颗粒表面的硼酸基团与脂多糖中糖链上的顺势二羟基进行特异性识别并反应形成硼酸酯键，脂多糖在磁纳米颗粒表面形成类脂质双层，阻碍氢离子（H+）与磁纳米颗粒表面接触，抑制具有催化活性的二价铁离子（Fe2+）的形成，同时阻碍Fe2+从磁珠表面进入到溶液中，无法催化H2O2氧化ABTS，在特定波长处出现低的吸收峰，同时上清液呈现较浅的绿色。在这个检测体系中，磁纳米颗粒表面硼酸基团与脂多糖的特异性结合和脂多糖类脂质双层阻碍H+运输及抑制Fe2+形成运输的高特异性、以及磁纳米颗粒类似于过氧化物酶的催化活性的高灵敏度的特点，使高灵敏高特异性分析检测脂多糖成为可能。根据上述专利技术构思，本专利技术采用下述技术方案：一种检测脂多糖的比色传感器，主要由试剂盒、固液分离装置、紫外-可见光谱分析装置、分析系统和控制系统组成，所述控制系统控制试剂盒中的试剂的供应和检测数据的输入和输出；将3-氨基苯硼酸修饰到磁纳米颗粒上，利用固液分离装置，得到磁纳米颗粒表面覆盖硼酸识别基团的MNPs磁纳米颗粒，并制备覆盖硼酸识别基团的MNPs磁纳米颗粒溶液，作为第一识别试剂，存储设置于第一试剂盒中；在酸性条件下，按照2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐和过氧化氢的设定混合比例，将2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐与过氧化氢进行混合，制成ABTS-H2O2酸性溶液体系，作为第二识别试剂，存储设置于第二试剂盒中；按照设定混合比例，以第一识别试剂中的MNPs磁纳米颗粒作为催化剂，以过氧化氢作为氧化剂，将所述第一识别试剂和所述第二识别试剂作为反应物进行混合，制成MNPs-ABTS-H2O2反应物体系，反应后形成的产物体系溶液，作为参照试剂，利用紫外-可见光谱分析装置，检测参照试剂的光谱，并以所述参照试剂作为具有特征光谱的参考元件；按照设定混合比例另外取用所述第一识别试剂和所述第二识别试剂，首先将所述第一识别试剂首先与待测的脂多糖样品溶液混合，得到脂多糖类脂质双层覆盖的磁纳米颗粒溶液，作为初步的目标检测样品的MNPs-LPS体系溶液，然后将MNPs-LPS体系溶液和所述第二识别试剂混合，经过至少5min后形成优化的目标检测样品的MNPs-LPS-ABTS-H2O2试剂体系，使MNPs-LPS-ABTS-H2O2试剂体系作为最终的目标检测样品试剂，利用紫外-可见光谱分析装置，检测MNPs-LPS-ABTS-H2O2试剂体系的光谱，通过分析系统与所述参照试剂的特征光谱进行对比，并通过光谱对比结果来确定所检测的脂多糖的含量水平。作为本专利技术优选的技术方案，在第一识别试剂所述MNPs磁纳米颗粒溶液中的3-氨基苯硼酸修饰的磁纳米颗粒的质量分数不低于2%（w/v）。作为上述技术方案进一步优选的技术方案，在第二识别试剂ABTS-H2O2酸性溶液体系中，2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐和过氧化氢混合摩尔配比为1：（0.7～0.9）。作为上述技术方案进一步优选的技术方案，按照MNPs磁纳米颗粒质量和ABTS-H2O2酸性溶液中的ABTS的摩尔数为1：0.005～1：0.02（g/mol）的比例进行混合，分别制备MNPs-ABTS-H2O2反应体系和MNPs-LPS-ABTS-H2O2试剂体系。作为上述技术方案进一步优选的技术方案，设置建立待测的脂多糖样品溶液的脂多糖浓度和特定波长处MNPs-LPS-ABTS-H2O2试剂体系的吸光度值之间的曲线关系的计算模块，对待测的脂多糖样品溶液的脂多糖浓度进行定量计算，并通过输出装置将脂多糖浓度检测结果进行输出。一种本专利技术检测脂多糖的比色传感器的制备方法，包括如下步骤：a.将3-氨基苯硼酸修饰到磁纳米颗粒上，得到磁纳米颗粒表面覆盖硼酸识别基团的MNPs磁纳米颗粒溶液，作为第一识别试剂，MNPs磁纳米颗粒溶液中的3-氨基苯硼酸修饰的磁纳米颗粒的质量分数不低于2%（w/v）；b.在酸性条件下，按照2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐和过氧化氢混合摩尔配比为1：（0.7～0.9）的混合比例，将2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐与过氧化氢进行混合，制成ABTS-H2O2酸性溶液体系，作为第二识别试剂；c.按照MNPs磁纳米颗粒质量和ABTS-H2O2酸性溶液中的ABTS的摩尔数为1：0.005～1：0.02（g/mol）的比例，取用在所述步骤a中制备的第一识别试剂和在所述b中得到的第二识别试剂，首先将所述第一识别试剂首先与待测的脂多糖样品溶液混合，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测脂多糖的比色传感器，其特征在于：主要由试剂盒、固液分离装置、紫外‑可见光谱分析装置、分析系统和控制系统组成，所述控制系统控制试剂盒中的试剂的供应和检测数据的输入和输出；将3‑氨基苯硼酸修饰到磁纳米颗粒上，利用固液分离装置，得到磁纳米颗粒表面覆盖硼酸识别基团的MNPs磁纳米颗粒，并制备覆盖硼酸识别基团的MNPs磁纳米颗粒溶液，作为第一识别试剂，存储设置于第一试剂盒中；在酸性条件下，按照2,2‑联氮‑二（3‑乙基‑苯并噻唑‑6‑磺酸）二铵盐和过氧化氢的设定混合比例，将2,2‑联氮‑二（3‑乙基‑苯并噻唑‑6‑磺酸）二铵盐与过氧化氢进行混合，制成ABTS‑H2O2酸性溶液体系，作为第二识别试剂，存储设置于第二试剂盒中；按照设定混合比例，以第一识别试剂中的MNPs磁纳米颗粒作为催化剂，以过氧化氢作为氧化剂，将所述第一识别试剂和所述第二识别试剂作为反应物进行混合，制成MNPs‑ABTS‑H2O2反应物体系，反应后形成的产物体系溶液，作为参照试剂，利用紫外‑可见光谱分析装置，检测参照试剂的光谱，并以所述参照试剂作为具有特征光谱的参考元件；按照设定混合比例另外取用所述第一识别试剂和所述第二识别试剂，首先将所述第一识别试剂首先与待测的脂多糖样品溶液混合，得到脂多糖类脂质双层覆盖的磁纳米颗粒溶液，作为初步的目标检测样品的MNPs‑LPS体系溶液，然后将MNPs‑LPS体系溶液和所述第二识别试剂混合，经过至少5 min后形成优化的目标检测样品的MNPs‑LPS‑ABTS‑H2O2试剂体系，使MNPs‑LPS‑ABTS‑H2O2试剂体系作为最终的目标检测样品试剂，利用紫外‑可见光谱分析装置，检测MNPs‑LPS‑ABTS‑H2O2试剂体系的光谱，通过分析系统与所述参照试剂的特征光谱进行对比，并通过光谱对比结果来确定所检测的脂多糖的含量水平。...

【技术特征摘要】
1.一种检测脂多糖的比色传感器，其特征在于：主要由试剂盒、固液分离装置、紫外-可见光谱分析装置、分析系统和控制系统组成，所述控制系统控制试剂盒中的试剂的供应和检测数据的输入和输出；将3-氨基苯硼酸修饰到磁纳米颗粒上，利用固液分离装置，得到磁纳米颗粒表面覆盖硼酸识别基团的MNPs磁纳米颗粒，并制备覆盖硼酸识别基团的MNPs磁纳米颗粒溶液，作为第一识别试剂，存储设置于第一试剂盒中；在酸性条件下，按照2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐和过氧化氢的设定混合比例，将2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐与过氧化氢进行混合，制成ABTS-H2O2酸性溶液体系，作为第二识别试剂，存储设置于第二试剂盒中；按照设定混合比例，以第一识别试剂中的MNPs磁纳米颗粒作为催化剂，以过氧化氢作为氧化剂，将所述第一识别试剂和所述第二识别试剂作为反应物进行混合，制成MNPs-ABTS-H2O2反应物体系，反应后形成的产物体系溶液，作为参照试剂，利用紫外-可见光谱分析装置，检测参照试剂的光谱，并以所述参照试剂作为具有特征光谱的参考元件；按照设定混合比例另外取用所述第一识别试剂和所述第二识别试剂，首先将所述第一识别试剂首先与待测的脂多糖样品溶液混合，得到脂多糖类脂质双层覆盖的磁纳米颗粒溶液，作为初步的目标检测样品的MNPs-LPS体系溶液，然后将MNPs-LPS体系溶液和所述第二识别试剂混合，经过至少5min后形成优化的目标检测样品的MNPs-LPS-ABTS-H2O2试剂体系，使MNPs-LPS-ABTS-H2O2试剂体系作为最终的目标检测样品试剂，利用紫外-可见光谱分析装置，检测MNPs-LPS-ABTS-H2O2试剂体系的光谱，通过分析系统与所述参照试剂的特征光谱进行对比，并通过光谱对比结果来确定所检测的脂多糖的含量水平。2.根据权利要求1所述检测脂多糖的比色传感器，其特征在于：作为第一识别试剂，在所述MNPs磁纳米颗粒溶液中的3-氨基苯硼酸修饰的磁纳米颗粒的质量分数不低于2%（w/v）。3.根据权利要求1所述检测脂多糖的比色传感器，其特征在于：作为第二识别试剂，在ABTS-H2O2酸性溶液体系中，2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐和过氧化氢混合摩尔配比为1：（0.7～0.9）。4.根据权利要求1所述检测脂多糖的比色传感器，其特征在于：按照MNPs磁纳米颗粒质量和ABTS-H2O2酸性溶液中的ABTS的摩尔数为1：0.005～1：0.02（g/mol）的比例进行混合，分别制备MNPs-ABTS-H2O2反应体系和MNPs-LPS-ABTS-H2O2试剂体系。5.根据权利要求1～4中任意一项所述检测脂多糖的比色传感器，其特征在于：设置建立待测的脂多糖样品溶液的脂多糖浓度和特定波长处MNPs-LPS-ABTS-H2O2试剂体系的吸光度值之间的曲线关系的计算模块，对待测的脂多糖样品溶液的脂多糖浓度进行定量计算，并通过输出装置将脂多糖浓度检测结果进行输出。6.一种权利要求1所述检测脂多糖的比色传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：a.将3-氨基苯硼酸修饰到磁...

【专利技术属性】
技术研发人员：李根喜，张娟，李得凤，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：上海;31