一株皮疽诺卡氏菌株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一株皮疽诺卡氏菌株及其应用，属生物农药领域。本发明专利技术的皮疽诺卡氏菌(Nocardia farcinica)于2016年4月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO.12344。保藏单位地址：北京市朝阳区北晨西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明专利技术的皮疽诺卡氏菌(Nocardia farcinica)株在制备毒杀南方根结线虫J2的生物药物中的应用。本发明专利技术的优点在于：皮疽诺卡氏菌对南方根结线虫J2毒杀时效快、防效高；对农产品、人畜和环境均无污染；能够用于制备生物农药。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一株皮疽诺卡氏菌株及其应用，属生物农药领域。
技术介绍
植物寄生线虫(plantparasiticnematodes)是世界范围难以防治的重要的植物病害。该线虫寄生范围广，适应环境能力强，可侵染2000多种植物。在引起植物侵染性病害的四大病原生物中，根结线虫危害程度已超过细菌和病毒，仅次于病原真菌。全球每年因作物病原线虫造成的直接经济损失高达1570亿美元，并呈现逐年上升的趋势。其中，根结线虫属(Meloidogynespp.)每年对世界农业造成的损失数百亿美元，在危害较为严重的地方，经常会引起枯萎病、根腐病等真菌病害的伴随发生，给我国农业生产造成巨大损失。随着现代化设施农业的快速发展，根结线虫已成为限制世界农业发展的关键因素之一。目前已发现根结线虫90多个种，常见的主要有南方根结线虫(Meloidogyneincognita)、花生根结线虫(Meloidogynearenaria)、北方根结线虫(Meloidogynehapla)、爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)等4个种。其中南方根结线虫最为普遍，对农作物引起的危害也最为严重。目前，根结线虫的防治主要是采用传统的防治方法，包括植物检疫、抗病品种选育、农业防治、物理防治、化学防治和生物防治。植物检疫是预防毁灭性入侵线虫的有效办法，但其对于世界性农业为害的根结线虫没有实质意义；抗病品种选育是一项高效、经济且无公害的防治措施，但其面临远缘杂交、性不亲和、杂交和分离世代长以及抗源僵乏和抗源基因不稳定表达等问题，使该项工作开展比较困难；农业防治主要包括轮作、日晒土壤、种植诱捕植物和调节播期等农业技术措施，是我国主要采用的防治线虫方法。轮作是采取寄主植物与非寄主植物隔年或隔几年轮换种植，然而根结线虫属寄主范围广泛，日常种植的作物基本上都是根结线虫的寄主，轮作对根结线虫防效甚微；化学防治是使用来源于微生物和植物的农药或化学合成的农药来防治植物病虫害，主要是采用甲基嗅熏蒸土壤或高毒、高残留杀线虫药剂，虽然能起到立竿见影的防效，但其费用昂贵，对农产品、人畜和环境均造成严重污染，导致农田土壤质量严重退化，容易产生抗药性；生物防治是指在人为的干预下利用天敌降低有害生物群体数量的过程，生物防治根结线虫研究最多的是天敌真菌和天敌细菌。杀线虫真菌分布非常广泛，分为两种类型，即捕食性真菌和寄生性真菌，然而，由于土壤的抑菌作用抑制了天敌真菌孢子的萌发，捕食真菌和寄生真菌在农业生产上均不能取得显著的防效；在天敌细菌中，研究和报道较多是穿刺巴氏杆菌(Pasteuriapenetrans)，但因其专性寄生而难以实现大规模培养，制剂成本较高。在科技日益发展的今天，农业害虫的生物防治已经受到越来越多的重视，也更加符合国家农业发展的战略要去，其效果也是显而易见的。然而，对于日益严重的根结线虫病害，目前的生物防治在农业生产过程中依然呈现出时效慢、防效低的特点，所以寻找或筛选出土源性的、能毒杀根结线虫的细菌具有重要的理论和实用价值。本专利技术涉及的皮疽诺卡氏菌株，关于其对根结线虫线虫的毒杀效果和相关机理尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于为开发高效生物农药，而提供一株皮疽诺卡氏菌株及其应用。本专利技术筛选到的一株对南方根结线虫J2高效毒杀的皮疽诺卡氏菌(Nocardiaspp)，其特征为：气生菌丝呈纤细状,菌落在BHI培养基平板上表现为微黄色菌落且伴有典型性褶皱产生(附图1B)，其基因组经特异性引物Nfar-T(HasegawaT,GonoiT,ItoJ,etal.2007)克隆后，出现仅皮疽诺卡氏菌才有的283bp的特异性产物片段(附图1B)，且用细菌通用引物(27F,1492R)克隆出1245bp的片段(见附件“Nocardiafarcinica16S核酸序列”)，因而确定其为皮疽诺卡氏菌(Nocardiafarcinica)。本专利技术的皮疽诺卡氏菌(Nocardiafarcinica)于2016年4月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNO.12344。保藏单位地址：北京市朝阳区北晨西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本专利技术是这样实现的：筛选纯化出皮疽诺卡氏菌(Nocardiafarcinica)后，测其对南方根结线虫二龄幼虫的毒杀效果。皮疽诺卡氏菌的纯化、培养方法(以下为重量百分比)：1.平板纯化培养LB平板培养基配方为：0.5％YeastExtract，1％Tryptone，1％NaCl，2％Agar，pH自然。将菌体涂布到平板培养基上，37℃下培养48h，待单菌落表面出现皱褶时，获取单菌落。2.液体扩大培养将LB平板上的单菌落接种到pH自然的液体培养基BHI(牛脑200.0g、牛心浸出汁250.0g、蛋白胨10.0g、葡萄糖2.0g、NaCl5.0g、1L去离子水)恒温摇床37℃培养48h，转速为180rpm。皮疽诺卡氏菌对南方根结线虫毒杀效果的测定1.J2幼虫的收集和体表消毒拔起萎蔫、下部叶片发黄的植株，剪掉地上部分，将根部冲洗干净，选取根部卵块呈米黄色而量多的番茄，用灭菌的解剖针挑取成熟卵块并将其置于40μm细胞筛网。挑取后将筛网和卵块置于2％的次氯酸钠中1min，期间缓慢振动筛网。无菌水冲洗卵块5-7次后将筛网放置于装有15ml无菌水的6cm培养板中28℃恒温培养箱中孵化，48h离心收集幼虫。向离心管中加入1ml0.001％醋酸氯己定，放置于DNA混合仪上转动1h。其次，离心并用无菌水洗涤J2幼虫3-5次。然后，再向离心管中加入1ml0.01％氯化汞溶液，7min后离心并用无菌水洗涤J2幼虫3-5次。最后，将J2制成浓度为40条/μl的线虫悬浮液。2.菌株对J2毒杀能力的测定用移液枪吸取400μl37℃下培养48h皮疽诺卡氏菌发酵液滴加到60mm无菌水琼脂板中央，并用涂布器均匀涂布使之均匀分布于水琼脂板表面，向水琼脂平板加等体积的BHI培养液或无菌水设为对照。将水琼脂板置于超净工作台中吹干，然后向水琼脂板中央加入50μl的J2悬浮液。板将加有J2的水琼脂平板放置于28℃，每隔24h在显微镜下统计J2的存活情况。3.毒杀效果计算当J2在平板上呈现僵直状态并经机械刺激后，5s内仍然没有活动的判定为死亡，反之则认为存活状态。存活率(％)＝N死/N总毒杀效果(％)＝存活率(BHI)-存活率(皮疽诺卡氏菌)本专利技术的皮疽诺卡氏菌株在制备毒杀南方根结线虫J2的生物药中的应用。本专利技术的优点在于：皮疽诺卡氏菌对南方根结线虫J2毒杀时效快、防效高；对农产品、人畜和环境均无污染；能够用于制备生物农药。附图说明图1：皮疽诺卡氏菌的单菌落和特异性引物扩增产物电泳图(A:皮疽诺卡氏菌在BHI培养基上的单菌落；B:皮疽诺卡氏菌基因组经特异性引物扩增后的产物电泳，M:1000bpmarker,1:皮疽诺卡氏特异性产物，283bp)图2：96h内J2在浓度梯度的皮疽诺卡氏菌液下的存活率统计结果(A,B,C和D分别指：J2在浓度梯度的皮疽诺卡氏菌液下在24h，48h,72h和96h的存活率统计。具体实施方式本专利技术实施例中的皮疽诺卡氏菌的纯化、培养方法及对南方根结线虫毒杀效果的测定同
技术实现思路
部分所述。实施例子中的皮疽诺卡氏菌菌液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株皮疽诺卡氏菌(Nocardia farcinica)株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO.12344。

【技术特征摘要】
1.一株皮疽诺卡氏菌(Nocardiafarcinica)株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCN...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹成钢，康颖倩，陆朝军，吴沁翼，张克勤，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：云南;53