一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架的鉴别方法技术

本发明专利技术公开了一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架的鉴别方法，包括如下步骤：(1)点样：采用至少两块硅胶G薄层板，取丙氨酸对照品溶液和供试品溶液适量，点样于第一块薄层板上；取内消旋二氨基庚二酸对照品溶液和供试品溶液适量，点样于第二块薄层板上；(2)展开：第一块薄层板放入正丁醇-冰醋酸-水(体积比8:3:1)展开剂中，第二块薄层板放入十二烷基硫酸钠-正丁醇-正己烷-水(体积比6:25:6:20)展开剂中；浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5～1.0cm，勿将样点浸入展开剂中，密封顶盖，待展开至薄层板的2/3处，取出薄层板，晾干；(3)显色；(4)观察。本发明专利技术结果显色清晰，分离度高，可靠性强。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，包括如下步骤：(1)点样：采用至少两块硅胶G薄层板，取丙氨酸对照品溶液和供试品溶液适量，点样于第一块薄层板上；取内消旋二氨基庚二酸对照品溶液和供试品溶液适量，点样于第二块薄层板上；(2)展开：第一块薄层板放入正丁醇-冰醋酸-水(体积比8:3:1)展开剂中，第二块薄层板放入十二烷基硫酸钠-正丁醇-正己烷-水(体积比6:25:6:20)展开剂中；浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5～1.0cm，勿将样点浸入展开剂中，密封顶盖，待展开至薄层板的2/3处，取出薄层板，晾干；(3)显色；(4)观察。本专利技术结果显色清晰，分离度高，可靠性强。【专利说明】
本专利技术涉及生化领域，具体地涉及一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架的新鉴别方法。
技术介绍
红色诺卡氏菌（Nocardia rubra)是具有免疫活性的微生物，经过细胞破碎、去除 细胞内容物和蛋白质及脂类等组份物质，得到其细胞壁骨架。 红色诺卡氏菌细胞壁骨架是一种含诺卡氏霉菌酸、中性多糖以及粘肽的活性物 质，可刺激细胞免疫功能，并促进多种细胞因子分泌，参与抗肿瘤免疫过程，用于多种肿瘤 的治疗或辅助治疗。 在生产红色诺卡氏菌细胞壁骨架时，需要对其进行鉴定。现有技术的鉴定方法如 下：对细胞壁特征氨基酸内消旋二氨基庚二酸定性分析，其方法是利用纸层析方法，利用定 性滤纸作为固定相，采用甲醇、蒸馏水、1%盐酸和吡啶按体积比80:17. 5:2. 5 :0. 1的比例 作为移动相，茚三酮作为显色剂，其可以显示出橄榄色斑点，褪色后变黄色。但该方法的试 验结果如图1所示，清晰度、区分度不高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的红色诺卡氏菌细胞壁骨架的鉴别方法，以解决现 有技术存在的组分难以区分的问题。 本专利技术提供的技术方案如下： -种红色诺卡氏菌细胞壁骨架的鉴别方法，包括如下步骤： 使用两块硅胶薄层板，固定相为硅胶G，规格为40-60 X 80-120mm，厚度为 0. 20-0. 25mm。临用前在100-120°C活化25-35分钟，活化后置干燥器中备用。 ⑴点样 距薄层板底边〇. 5-2cm处作为点样基线，以1. 0?2. 0cm点间距离在点样基 线上画3个圆点，分别点样对照品溶液和供试品溶液；取丙氨酸对照品溶液和供试品溶 液1-6 μ 1，点样于第一块薄层板上；取内消旋二氨基庚二酸对照品溶液和供试品溶液 3-10 μ 1，点样于第二块薄层板上； ⑵展开 将点好丙氨酸对照品溶液和供试品溶液的第一块薄层板放入正丁醇-冰醋酸-水 (体积比8:3:1)展开剂中，将点好内消旋二氨基庚二酸对照品溶液和供试品溶液的第二块 薄层板放入十二烷基硫酸钠-正丁醇-正己烷-水（体积比6:25:6:20)展开剂中；浸入展 开剂的深度为距薄层板底边〇. 5?1. 0cm，勿将样点浸入展开剂中，密封顶盖，点丙氨酸溶 液的硅胶板需展开45-60分钟，点内消旋二氨基庚二酸溶液的硅胶板需展开90-110分钟， 待展开至薄层板的2/3处，取出薄层板，晾干； ⑶显色 将薄层板置通风橱中，喷茚三酮试液，将薄层板置鼓风干燥箱中，100-1KTC加热 至斑点显色清晰； ⑷观察 观察薄层板上供试品溶液和对照品溶液所显主斑点的位置和颜色。 其中，本专利技术薄层色谱的支撑基板可以为玻璃板、塑料板或铝板中的一种，优选为 玻璃板。 其中，丙氨酸对照品溶液和供试品溶液在第一块薄层板上的点样量优选为 1-5 μ 1，点样2 μ 1为佳。 其中，内消旋二氨基庚二酸对照品溶液和供试品溶液在第二块薄层板上的点样量 优选为3-8 μ 1，点样5 μ 1为佳。 本专利技术的优点如下： 1、诺卡氏菌细胞壁骨架水解成分十分复杂，而且内消旋二氨基庚二酸含量低，用 现有技术区分度不高。而采用本专利技术方法，各组分分离效果好，供试品溶液所显主斑点的位 置和颜色与对照品溶液基本一致，大大提高了鉴定结果的可靠性。 2、本专利技术方法操作、显色比较方便，薄层色谱法斑点集中，薄层板耐腐蚀。 3、本专利技术方法混合物易分离，分辨力比现有技术的方法高，显色清晰，分离度高， 可靠性强。 【专利附图】【附图说明】 图1为本专利技术中现有技术的红色诺卡氏菌细胞壁骨架的鉴别方法的结果图； 图2为本专利技术实施例1的结果图； 图3为本专利技术实施例2的结果图； 图4为本专利技术实施例3的结果图。 说明：图2至图4分别为三批注射用红色诺卡氏菌细胞壁骨架试验结果，从左至 右分别为对照品溶液中丙氨酸主斑点和供试品溶液（两个重复）中丙氨酸主斑点、对照品 溶液中内消旋二氨基庚二酸主斑点和供试品溶液（两个重复）中内消旋二氨基庚二酸主斑 点。 图中的结果表示，供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点基 本一致。 图5为对比例1的结果图； 图6为对比例2的结果图； 图7为对比例3的结果图。第一块薄层板从左到右依次为：丙氨酸对照品、供试 品、供试品；第二块薄层板从左到右依次为：内消旋二氨基庚二酸对照品、供试品、供试品。 【具体实施方式】 采用市售薄层板，固定相为硅胶G，涂布于玻璃板上，规格为50Χ 100mm，厚度为 0. 20-0. 25mm。临用前在110°C活化30分钟，活化后置干燥器中备用。 显色剂茚三酮试液的配制方法为：称取茚三酮2g，加入95 %乙醇溶解并稀释至 100ml，摇匀，即得。 0. 05mg/ml内消旋二氨基庚二酸对照品溶液的配制方法为：取内消旋二氨基庚二 酸约2. 5mg，置50ml容量瓶中，加入50 %乙醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。 0. lmg/ml丙氨酸对照品溶液的配制方法为：取丙氨酸约5. Omg，置50ml容量瓶中， 加入50 %乙醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。 供试品溶液的制备方法：取本品5瓶，混合，加6mol/L盐酸溶液0. 5ml，密封，置蒸 汽灭菌器中以120°C水解3?6小时，水解液转移至60_蒸发皿，置水浴锅上，水浴蒸干，残 渣加50%乙醇溶液lml使溶解，转移至干净的2ml西林瓶中，作为供试品溶液。 实施例1 ⑴点样 距薄层板底边1. Ocm处用2B铅笔画一直线作为点样基线，以1. Ocm点间距离在点 样基线上画3个圆点，分别点样对照品溶液和供试品溶液。取丙氨酸对照品溶液和供试品 溶液各2 μ 1，点样于薄层板上。取内消旋二氨基庚二酸对照品溶液和供试品溶液各5 μ 1， 点样于薄层板上。 ⑵展开 将点好丙氨酸对照品溶液和供试品溶液的薄层板放入正丁醇-冰醋酸-水 (8:3:1)展开剂中，将点好内消旋二氨基庚二酸对照品溶液和供试品溶液的薄层板放入 十二烷基硫酸钠-正丁醇-正己烷-水（6:25:6:20)展开剂中。浸入展开剂的深度为距薄 层板底边0. 5cm，勿将样点浸入展开剂中，密封顶盖，点丙氨酸溶液的硅胶板需展开约50分 钟，点内消旋二氨基庚二酸溶液的硅胶板需展开约100分钟，待展开至薄层板的约2/3处， 取出薄层板，晾干。 (3)显色 将薄层板置通风橱中，喷茚三酮试液。将薄层板置鼓风干燥箱中，105°C加热至斑本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架的鉴别方法，包括如下步骤：使用至少两块硅胶薄层板，固定相为硅胶G，规格为40‑60×80‑120mm，厚度为0.20‑0.25mm，临用前在100‑120℃活化25‑35分钟，活化后置干燥器中备用；(1)点样距薄层板底边0.5‑2cm处作为点样基线，以1.0～2.0cm点间距离在点样基线上画3个圆点，分别点样对照品溶液和供试品溶液；取丙氨酸对照品溶液和供试品溶液1‑6μl，点样于第一块薄层板上；取内消旋二氨基庚二酸对照品溶液和供试品溶液3‑10μl，点样于第二块薄层板上；(2)展开将点好丙氨酸对照品溶液和供试品溶液的第一块薄层板放入体积比8:3:1的正丁醇‑冰醋酸‑水展开剂中，将点好内消旋二氨基庚二酸对照品溶液和供试品溶液的第二块薄层板放入体积比6:25:6:20的十二烷基硫酸钠‑正丁醇‑正己烷‑水展开剂中；浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5～1.0cm，勿将样点浸入展开剂中，密封顶盖，点丙氨酸溶液的硅胶板需展开45‑60分钟，点内消旋二氨基庚二酸溶液的硅胶板需展开90‑110分钟，待展开至薄层板的2/3处，取出薄层板，晾干；(3)显色将薄层板置通风橱中，喷茚三酮试液，将薄层板置鼓风干燥箱中，100‑110℃加热至斑点显色清晰；(4)观察观察薄层板上供试品溶液和对照品溶液所显主斑点的位置和颜色。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐镜，钟丽芳，查贝贝，谢必峰，金勇，邵恩文，
申请(专利权)人：福建省山河药业有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35