工程化的亚胺还原酶和用于酮和胺化合物的还原胺化的方法技术

本申请提供了具有亚胺还原酶活性的工程化的多肽、编码所述工程化的亚胺还原酶的多核苷酸、能够表达所述工程化的亚胺还原酶的宿主细胞以及使用这些工程化的多肽与一系列酮和胺底物化合物制备仲胺和叔胺产物化合物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请要求2013年11月13日提交的美国临时专利申请系列号61/903,772、2014年7月9日提交的美国临时专利申请系列号62/022,315和2014年7月9日提交的美国临时专利申请系列号62/022,323的优先权，为了所有目的所述专利的每个通过引用全文并入。
本专利技术涉及工程化的多肽，所述工程化的多肽具有用于将多种酮和胺底物转化为仲胺产物和叔胺产物的亚胺还原酶活性。序列表、表格或计算机程序的引用序列表的正式复本作为ASCII格式化文本文件与说明书经EFS-Web同时被提交，具有文件名“CX2-136USP2A_ST25.txt”，创建日期2014年7月8日，且大小为2,171千字节。经EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分且通过引用全部并入本文。背景手性仲胺和叔胺是制药业中重要的基础材料。不存在有效的已知产生这类手性胺化合物的生物催化途径。现存的化学方法使用手性硼试剂或者多步合成。在仲胺的生物催化合成的文献中存在一些报道。报道了厌氧细菌伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)全细胞还原次苄基亚胺和次丁基亚胺的亚胺还原酶活性(Chadha等,Tetrahedron:Asym.,19:93-96[2008])。另一个报道使用伍氏醋酸杆菌的全细胞使用水性介质中的苯甲醛或丁醛和丁胺或苯胺(Stephens等,Tetrahedron 60:753-758[2004]))。报道了链霉菌属(Streptomyces sp.)GF3587和GF3546立体选择性地还原2-甲基-1-吡咯啉(Mitsukara等,Org.Biomol.Chem.8:4533-4535[2010])。在开发用于这种类型的反应的生物催化途径中的一个挑战是鉴定能够被工程化以提供在工业应用条件下有效进行这类反应的酶类型。冠瘿碱脱氢酶是一类使用NADH或NADPH作为辅因子作用于CH-NH键的氧化还原酶。冠瘿碱脱氢酶的天然反应是α-酮酸与氨基酸的还原胺化。已经鉴定了至少五个天然存在的具有一些同源性的基因，所述基因编码具有冠瘿碱脱氢酶类的特征性活性的酶。这五个酶包括：来自节杆菌属(Arthrobactor sp.)菌株1C的冠瘿碱脱氢酶(CENDH)；来自欧洲大扇贝(Pecten maximus)(大扇贝)的章鱼碱脱氢酶(OpDH)；来自乳酸乳球菌K1(Lactococcus lactis K1)的鸟氨酸合成酶(CEOS)；来自斗笠螺(Cellana grata)的β-丙氨酸冠瘿碱脱氢酶(BADH)；来自居蟹皮海绵(Suberites domuncula)的tauropine脱氢酶(TauDH)。已经确定了冠瘿碱脱氢酶CENDH的晶体结构(参见Britton等,“Crystal structure and active site location of N-(1-D-carboxyethyl)-L-norvaline dehydrogenase,”Nat.Struct.Biol.5(7):593-601(1998))。另一个酶，来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的N-甲基L-氨基酸脱氢酶(NMDH)已知具有类似于冠瘿碱脱氢酶的活性，与α-酮酸和烷基胺反应，但是似乎与冠瘿碱脱氢酶和氨基酸脱氢酶具有很小或者不具有序列同源性。NMDH已经被表征为属于一个新的NAD(P)依赖性的氧化还原酶超家族(参见，例如US 7,452,704B2；和Esaki等,FEBS J.,272,1117-1123[2005])。本领域中存在对生物催化剂和在工业可适用的条件下使用它们用于合成手性仲胺和叔胺的方法。概述本专利技术提供了新的生物催化剂和相关的方法，所述方法使用所述新的催化剂用于使用未活化的酮和未活化的胺作为底物通过直接还原胺化合成手性仲胺和叔胺。本专利技术的生物催化剂是通过SEQ ID NO:6的工程化的酶的定向进化衍生的工程化的多肽变体，所述SEQ ID NO:6的工程化的酶继而通过来自节杆菌属菌株IC的初始野生型基因的定向进化产生，所述初始野生型菌株编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的冠瘿碱脱氢酶。这些工程化的多肽能够催化酮(包括未活化的酮底物诸如环己酮和2-戊酮)或者醛底物与伯胺或仲胺底物(包括未活化的胺底物诸如丁胺、苯胺、甲胺和二甲胺)形成仲胺或叔胺产物化合物的转化。这些衍生自冠瘿碱脱氢酶的工程化的多肽的酶活性被称为“亚胺还原酶活性”，并且本文公开的工程化的酶也被称为“亚胺还原酶”或者“IRED”。IRED的一般亚胺还原酶活性在以下的方案1中阐明。方案1本专利技术的具有亚胺还原酶活性的工程化的多肽能够接受大范围的底物。因此，在方案1的生物催化反应中，式(I)的底物的R1和R2基团独立地选自氢原子或任选地取代的烷基、烯基、炔基、烷氧基、羧基、氨基羰基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、羧烷基、氨基烷基、卤烷基、烷基硫代烷基、环烷基、芳基、芳基烷基、杂环烷基、杂芳基和杂芳基烷基；并且式(II)的底物的R3和R4基团独立地选自氢原子和任选地取代的烷基、烯基、炔基、烷氧基、羧基、氨基羰基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、羧烷基、氨基烷基、卤烷基、烷基硫代烷基、环烷基、芳基、芳基烷基、杂环烷基、杂芳基和杂芳基烷基，条件是R3和R4二者不能都是氢。任选地，式(I)的底物的R1和R2基团和式(II)的底物的R3和R4基团的任一或二者可连接以形成3元至10元环。此外，方案1的生物催化反应可以是分子内反应，其中式(I)的化合物的R1和R2基团中的至少一个连接至式(II)的化合物的R3和R4基团中的至少一个。并且，在式(III)的产物化合物中的由“*”指示的碳原子和/或氮中的其一或二者可以是手性的。如在本文中进一步描述的，具有亚胺还原酶活性的工程化的多肽展示出立体选择性，因此，方案1的亚胺还原酶反应可被用于在单个生物催化反应中建立式(III)的产物化合物的一个、两个或更多个手性中心。在一些实施方案中，本专利技术提供了工程化的多肽，所述工程化的多肽包含与SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸参考序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且还包含与所述参考氨基酸序列相比的一个或更多个氨基酸残基差异，其中所述工程化的多肽具有亚胺还原酶活性。在所述工程化的多肽的一些实施方案中，亚胺还原酶活性是方案1的活性，任选地，如表2中公开的反应。此外，如上文所述，已经确定了冠瘿碱脱氢酶CENDH的晶体结构(参见，例如，Britton等,“Crystal structure and active site location of N-(1-D-carboxyethyl)-L-norvaline dehydrogenase,”Nat.Struct.Biol.5:593-601[1998])。因此，本文公开的多个氨基酸差异与功能活性的关联与已知的野生型酶CENDH的三维结构一起能够为普通技术人员提供足以合理地对本文提供的多肽(以及对包括OpDH、BADH、CEOS和TauDH在内的同源的冠瘿碱脱氢酶)构建另外的氨基酸残基改变并保持或改进亚胺还原酶活性或稳定性特性的信息。在一些实施方案中，考虑这类改进可以包括将本专利技术的工程化的多肽构建为具有使用一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种工程化的多肽，包含与SEQ ID NO:6的参考序列具有至少80％序列同一性以及以下特征中的至少一个的氨基酸序列：(i)与SEQ ID NO:6的参考序列相比在选自以下的位置处的残基差异：X12、X18、X26、X27、X57、X65、X87、X93、X96、X126、X138、X140、X142、X159、X170、X175、X177、X195、X200、X221、X234、X241、X242、X253、X254、X257、X262、X263、X267、X272、X276、X277、X278、X281、X282、X291和X352，任选地其中在所述位置处的残基差异选自X12M、X18G、X26M/V、X27S、X57D/L/V、X65I/V、X87A、X93G/Y、X96C、X126S、X138L、X140M、X142A、X159C/L/Q/V、X170F/K/R/S、X175R、X177R、X195S、X200S、X221F、234C/L、X241K、X242C/L、X253K/N、X254R、X257Q、X262F/G/P/V、X263C/D/E/H/I/K/L/M/N/P/Q/V、X267E/G/H/I/N/S、X272D、X276L、X277H/L、X278E/H/K/N/R/S/W、X281A、X282A/R、X291E和X352Q；(ii)选自以下的与SEQ ID NO:6的参考序列相比的残基差异：X20V、X29K、X37P、X74W、X82C/T、X94N、X108S、X111A/H、X141M/N、X143F/L/Y、X153E/F、X154C/D/G/K/L/N/S/T/V、X156H/L/N/M/R、X157F/Q/T/Y、X158I/L/R/S/T/V、X163V、X197V、X201I、X220C/K/Q、X223S、X256A/E/I/L/S/T、X259C/R、X260A/D/N/Q/V/Y、X261E/F/H/L/P/Q/Y、X264V、X270L、X273C、X274L/S、X279T、X284C/F/H/P/Q/S、X292E/P和X295F；和/或(iii)选自以下的与SEQ ID NO:6的参考序列相比的两个或更多个残基差异：X153Y、X283V、X82P、X141W、X154F、X259I/L/M、X274L/M和X296N/V；其中所述多肽具有亚胺还原酶活性。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.13 US 61/903,772;2014.07.09 US 62/022,315;1.一种工程化的多肽，包含与SEQ ID NO:6的参考序列具有至少80％序列同一性以及以下特征中的至少一个的氨基酸序列：(i)与SEQ ID NO:6的参考序列相比在选自以下的位置处的残基差异：X12、X18、X26、X27、X57、X65、X87、X93、X96、X126、X138、X140、X142、X159、X170、X175、X177、X195、X200、X221、X234、X241、X242、X253、X254、X257、X262、X263、X267、X272、X276、X277、X278、X281、X282、X291和X352，任选地其中在所述位置处的残基差异选自X12M、X18G、X26M/V、X27S、X57D/L/V、X65I/V、X87A、X93G/Y、X96C、X126S、X138L、X140M、X142A、X159C/L/Q/V、X170F/K/R/S、X175R、X177R、X195S、X200S、X221F、234C/L、X241K、X242C/L、X253K/N、X254R、X257Q、X262F/G/P/V、X263C/D/E/H/I/K/L/M/N/P/Q/V、X267E/G/H/I/N/S、X272D、X276L、X277H/L、X278E/H/K/N/R/S/W、X281A、X282A/R、X291E和X352Q；(ii)选自以下的与SEQ ID NO:6的参考序列相比的残基差异：X20V、X29K、X37P、X74W、X82C/T、X94N、X108S、X111A/H、X141M/N、X143F/L/Y、X153E/F、X154C/D/G/K/L/N/S/T/V、X156H/L/N/M/R、X157F/Q/T/Y、X158I/L/R/S/T/V、X163V、X197V、X201I、X220C/K/Q、X223S、X256A/E/I/L/S/T、X259C/R、X260A/D/N/Q/V/Y、X261E/F/H/L/P/Q/Y、X264V、X270L、X273C、X274L/S、X279T、X284C/F/H/P/Q/S、X292E/P和X295F；和/或(iii)选自以下的与SEQ ID NO:6的参考序列相比的两个或更多个残基差异：X153Y、X283V、X82P、X141W、X154F、X259I/L/M、X274L/M和X296N/V；其中所述多肽具有亚胺还原酶活性。2.如权利要求1所述的工程化的多肽，其中所述氨基酸序列包含选自以下的与SEQ ID NO:6的参考序列相比的至少一个残基差异：X12M、X37P、X82T、X111A、X154S、X156N/M、X223S、X256E、X260D、X261H、X262P、X263C/E/Q、X267G、X277L、X281A、X284P/S和X292E。3.如权利要求1所述的工程化的多肽，其中所述氨基酸序列包含选自以下的与SEQ ID NO:6的参考序列相比的至少一个残基差异：X256E、X93G/Y、X94N、X96C、X111A/H、X142A、X159L、X163V、X259R、X273C和X284P/S。4.如权利要求1所述的工程化的多肽，其中所述氨基酸序列包含选自以下的与SEQ ID NO:6的参考序列相比的至少两个残基差异：X82C/P/T、X141W、X143W、X153Y、X154F/Q/Y、X256V、X259I/L/M/T、X260G、X261R、X265L、X273W、X274M、X277A/I、X279L、X283V、X284L、X296N、X326V。5.如权利要求1所述的工程化的多肽，其中所述氨基酸序列包含选自以下的与SEQ ID NO:6的参考序列相比的至少一个残基差异组合：(a)X153Y和X283V；(b)X141W、X153Y和X283V；(c)X141W、X153Y、X274L/M和X283V；(d)X141W、X153Y、X154F、X274L/M和X283V；(e)X141W、X153Y、X154F和X283V；(f)X141W、X153Y、X283V和X296N/V；(g)X141W、X153Y、X274L/M、X283V和X296N/V；(h)X111A、X153Y、X256E、X274M和X283V；(i)X111A、X141W、X153Y、X273C、X274M、X283V和X284S；(j)X111A、X141W、X153Y、X273C和X283V；(k)X111A、X141W、X153Y、X154F、X256E、X274M、X283V、X284S和X296N；(l)X111A、X141W、X153Y、X256E、X273W、X274L、X283V、X284S和X296N；(m)X111H、X141W、X153Y、X273W、X274M、X284S和X296N；(n)X111H、X141W、X153Y、X154F、X273W、X274L、X283V、X284S和X296N；(o)X82P、X141W、X153Y、X256E、X274M和X283V；(p)X82P、X111A、X141W、X153Y、X256E、X274M、X283V、M284S和E296V；(q)X94N、X143W、X159L、X163V、X259M和X279L；(r)X141W、X153Y、X154F和X256E；和(s)X153Y、X256E和X274M。6.如权利要求5所述的工程化的多肽，其中所述氨基酸序列还包含选自以下的与SEQ ID NO:6的参考序列相比的至少一个残基差异：X12M、X18G、X20V、X26M/V、X27S、X29K、X37P、X57D/L/V、X65I/V、X74W、X82C/T、X87A、X93G/Y、X94N、X96C、X108S、X111A/H、X126S、X138L、X140M、X141M/N、X142A、X143F/L/Y、X153E/F、X154C/D/G/K/L/N/S/T/V、X156H/L/N/M/R、X157F/Q/T/Y、X158I/L/R/S/T/V、X159C/L/Q/V、X163V、X170F/K/R/S、X175R、X177R、X195S、X197V、X200S、X201I、X220C/K/Q、X221F、X223S、X234V/C/L、X241K、X242C/L、X253K/N、X254R、X256A/E/I/L/S/T、X257Q、X259C/R、X260A/D/N/Q/V/Y、X261E/F/H/L/P/Q/Y、X262P、X262F/G/V、X263C/D/E/H/I/K/L/M/N/P/Q/V、X264V、X267E/G/H/I/N/S、X270L、X272D、X273C、X274L/S、X276L、X277H/L、X278E/H/K/N/R/S/W、X279T、X281A、X282A/R、X284C/F/H/P/Q/S、X291E、X292E\...

【专利技术属性】
技术研发人员：尼古拉斯·J·阿加德，奥斯卡·阿尔维左，美利莎·安·梅奥，斯特法妮·额迈纳，詹姆斯·尼古拉斯·里金斯，杰弗里·C·穆尔，
申请(专利权)人：科德克希思公司，
类型：发明
国别省市：美国;US