本发明专利技术公开了一种腹泻性贝毒毒素的液相色谱‑串联质谱检测方法，包括下列步骤：（一）样品前处理、（二）HPLC‑MS/MS质谱检测。本研究建立9种代表性DSP毒素OA、DTX1、DTX2、PTX2、YTX、hYTX、GYM、SPX1和AZA1的液相色谱‑串联质谱(LC‑MS/MS)检测方法，该方法具有灵敏、高效和准确等特点，对DSP各毒素成分具有很强的定性、定量检测能力，以期有效弥补现有传统检测方法的弊端。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种腹泻性贝毒毒素的液相色谱-串联质谱检测方法，属于仪器检测
技术介绍
腹泻性贝毒(diarrhetic shellfish poisoning，DSP)毒素是由鳍藻(Dinophysis spp.)和原甲藻(Prorocentrum spp.)等海洋藻类产生的脂溶性海洋生物毒素，这些毒素经海洋贝类积累后通过食物链进入人体，严重危害人类健康安全。自1976年，日本报道首例DSP毒素中毒事件以来，世界各地沿海，特别是西欧、北欧和亚洲沿海各国均发现了DSP毒素。根据近年来对中国沿海部分海区的调查显示，辽东湾、胶州湾、莱州湾、秦皇岛、福建等海域双壳贝类已经广泛受到DSP毒素的污染。DSP毒素的主要化学结构为聚醚或大环内脂化合物，除常见的酸性成分大田软海绵酸(okadaic acid，OA)及其衍生物鳍藻毒素(dinophysistoxin1、2，DTX1、DTX2)以外，还有多种新型DSP毒素被发现，如中性成分聚醚内脂-蛤毒素2(pectenotoxin2，PTX2)，其他成分，硫酸盐化合物扇贝毒素(yessotoxin，YTX)及其衍生物(homo-yessotoxin，hYTX)，环亚胺米氏裸甲藻毒素(gymnodimine，GYM)和螺环内酯毒素1(spirolide1，SPX1)，原多甲藻酸(azaspiracid1，AZA1)。DSP毒素传统的检测方法主要有小鼠生物法(mouse bioassay，MBA)、免疫分析法(immunoassays，IA)和高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)。MBA法的主要缺陷是操作繁琐、缺乏特异性，贝类组织中的游离脂肪酸对小鼠毒性影响很大，假阳性率较高。IA法也同样存在假阳性率较高的问题，而且检测成分单一，结果不能代表样本整体毒性。HPLC法需要繁琐的衍生步骤，主要利用衍生化试剂9-蒽基叠氮甲烷(ADAM)和4-溴甲基7-甲氧基香豆素(BrMmc)等将DSP毒素衍生，使其在荧光检测器上获得更高灵敏度，同时，衍生化试剂还存在性质不稳定问题，有时会导致DSP毒素不能够完全的衍生化。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种腹泻性贝毒毒素的液相色谱-串联质谱检测方法，可以同时检测9种腹泻性贝毒毒素，并且回收率高。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供的腹泻性贝毒毒素的液相色谱-串联质谱检测方法，包括下列步骤：(一)样品前处理(1)样品提取流程如下：称取均质后的试样2.00g，置于50mL离心管中，加入80％乙腈水溶液8.0mL、2-8g氯化钠和2-8g氯化钙，超声提取5-10min后，7000r/min离心10min，取上清液备用；在离心管中继续加入30mL 30％乙醇水溶液和2-8g氯化钙，涡旋振荡5min，然后超声提取5-10min，以5000r/min离心5min，取上清液备用；将两次上清液合并，取2mL上清液，加入6mL超纯水稀释，共计8mL提取液待净化；(2)样品净化流程如下：先后以3mL乙腈、3mL水平衡固相萃取柱，8mL提取液全部过柱，流速1-3mL/min，以3mL 20％乙腈水溶液进行淋洗，充分吹干淋洗液，以1mL含有0.1％甲酸的乙腈洗脱，洗脱液待质谱检测；(二)HPLC-MS/MS质谱检测质谱检测条件(1)液相条件Waters Atlantis dC18反相色谱柱(150mm×2.1mm，5μm)；柱温30℃；进样量10μL；流动相A为水，B为95％乙腈水溶液，两者皆含有0.05％甲酸和2mmol/L甲酸铵。流动相洗脱条件如下表所示：梯度洗脱条件(2)质谱条件离子源:电喷雾离子源；扫描方式:ESI-/ESI+切换扫描；检测方式:多离子反应监测；离子源参数:碰撞气(CAD)10MPa，气帘气(CUR)10MPa，电喷雾电压(IS)4500V(-4500)，离子源温度(TEM)600℃；定性、定量离子对，去簇电压和碰撞能量见下表：*为定量子离子；优选的，流动注射泵以流速10μL/min速度进样。进一步的，本专利技术的9种DSP毒素的质谱条件的优化步骤是：首先进行一级质谱扫描获得分子离子峰，GYM、SPX1、AZA1分子离子为[M+H]+，PTX2分子离子为[M+NH4]+，OA、YTX、hYTX、DTX1、DTX2分子离子为[M-H]-；再进行二级质谱扫描获得相应的特征子离子峰，选择信号强度较高、干扰较小的两个子离子；然后通过多反应监测扫描模式对去簇电压、入口电压、碰撞能量和碰撞室出口电压的参数进行优化，使分子离子与特征子离子强度达到最大，确定最佳质谱参数；最后以流动注射进样考察离子源温度、雾化气、气帘气的参数。本专利技术中，所涉及的溶液，包括80％乙腈水溶液、30％乙醇水溶液、20％乙腈水溶液、0.1％甲酸的乙腈，0.05％甲酸等，都是体积分数。本研究建立9种代表性DSP毒素OA、DTX1、DTX2、PTX2、YTX、hYTX、GYM、SPX1和AZA1的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测方法，该方法具有灵敏、高效和准确等特点，对DSP各毒素成分具有很强的定性、定量检测能力，以期有效弥补现有传统检测方法的弊端。同时，本专利技术通过改进样品前处理工艺，在提取液中加入萃取剂-氯化钠和氯化钙，同时，对第一次提取后的残渣用乙醇进行二次提取，回收率大大提高。具体实施方式实施例1(一)样品前处理(1)样品提取流程如下：称取均质后的试样2.00g，置于50mL离心管中，加入80％乙腈水溶液8.0mL、6g氯化钠和3g氯化钙，超声提取10min后，7000r/min离心10min，取上清液备用；在离心管中继续加入30mL 30％乙醇水溶液和5g氯化钙，涡旋振荡5min，然后超声提取10min，以5000r/min离心5min，取上清液备用；将两次上清液合并，取2mL上清液，加入6mL超纯水稀释，共计8mL提取液待净化；(2)样品净化流程如下：先后以3mL乙腈、3mL水平衡固相萃取柱，8mL提取液全部过柱，流速1mL/min，以3mL 20％乙腈水溶液进行淋洗，充分吹干淋洗液，以1mL含有0.1％甲酸的乙腈洗脱，洗脱液待质谱检测；(二)HPLC-MS/MS质谱检测质谱检测条件(1)液相条件Waters Atlantis dC18反相色谱柱(150mm×2.1mm，5μm)；柱温30℃；进样量10μL；流动相A为水，B为95％乙腈水溶液，两者皆含有0.05％甲酸和2mmol/L甲酸铵。流动相洗脱条件如下表所示：梯度洗脱条件(2)质谱条件离子源:电喷雾离子源；扫描方式:ESI-/ESI+切换扫描；检测方式:多离子反应监测；离子源参数:碰撞气(CAD)10MPa，气帘气(CUR)10MPa，电喷雾电压(IS)4500V(-4500)，离子源温度(TEM)600℃；定性、定量离子对，去簇电压和碰撞能量见下表：*为定量子离子；流动注射泵以流速10μL/min速度进样。本专利技术的9种DSP毒素的质谱条件的优化步骤是：首先进行一级质谱扫描获得分子离子峰，GYM、SPX1、AZA1分子离子为[M+H]+，PTX2分子离子为[M+NH4]本文档来自技高网...
【技术保护点】
腹泻性贝毒毒素的液相色谱‑串联质谱检测方法，其特征在于，包括下列步骤：(一)样品前处理(1)样品提取流程如下：称取均质后的试样2.00g，置于50mL离心管中，加入80％乙腈水溶液8.0mL、2‑8g氯化钠和2‑8g氯化钙，超声提取5‑10min后，7000r/min离心10min，取上清液备用；在离心管中继续加入30mL 30％乙醇水溶液和2‑8g氯化钙，涡旋振荡5min，然后超声提取5‑10min，以5000r/min离心5min，取上清液备用；将两次上清液合并，取2mL上清液，加入6mL超纯水稀释，共计8mL提取液待净化；(2)样品净化流程如下：先后以3mL乙腈、3mL水平衡固相萃取柱，8mL提取液全部过柱，流速1‑3mL/min，以3mL 20％乙腈水溶液进行淋洗，充分吹干淋洗液，以1mL含有0.1％甲酸的乙腈洗脱，洗脱液待质谱检测；(二)HPLC‑MS/MS质谱检测质谱检测条件(1)液相条件Waters Atlantis dC18反相色谱柱(150mm×2.1mm，5μm)；柱温30℃；进样量10μL；流动相A为水，B为95％乙腈水溶液，两者皆含有0.05％甲酸和2mmol/L甲酸铵。流动相洗脱条件如下表所示：梯度洗脱条件(2)质谱条件离子源:电喷雾离子源；扫描方式:ESI‑/ESI+切换扫描；检测方式：多离子反应监测；离子源参数:碰撞气(CAD)10MPa，气帘气(CUR)10MPa，电喷雾电压(IS)4500V(‑4500)，离子源温度(TEM)600℃；定性、定量离子对，去簇电压和碰撞能量见下表：*为定量子离子。...
【技术特征摘要】
1.腹泻性贝毒毒素的液相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于，包括下列步骤：(一)样品前处理(1)样品提取流程如下：称取均质后的试样2.00g，置于50mL离心管中，加入80％乙腈水溶液8.0mL、2-8g氯化钠和2-8g氯化钙，超声提取5-10min后，7000r/min离心10min，取上清液备用；在离心管中继续加入30mL 30％乙醇水溶液和2-8g氯化钙，涡旋振荡5min，然后超声提取5-10min，以5000r/min离心5min，取上清液备用；将两次上清液合并，取2mL上清液，加入6mL超纯水稀释，共计8mL提取液待净化；(2)样品净化流程如下：先后以3mL乙腈、3mL水平衡固相萃取柱，8mL提取液全部过柱，流速1-3mL/min，以3mL 20％乙腈水溶液进行淋洗，充分吹干淋洗液，以1mL含有0.1％甲酸的乙腈洗脱，洗脱液待质谱检测；(二)HPLC-MS/MS质谱检测质谱检测条件(1)液相条件Waters Atlantis dC18反相色谱柱(150mm×2.1mm，5μm)；柱温30℃；进样量10μL；流动相A为水，B为95％乙腈水溶液，两者皆含有0.05％甲酸和2mm...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴振兴，鲍蕾，静平，贾俊涛，肖西志，梁成珠，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：山东;37
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