一种毒黄素的液相色谱-串联质谱检测方法技术

本发明专利技术公开了一种毒黄素的液相色谱-串联质谱检测方法，包括下列步骤：(1)样品前处理；(2)富集和净化；（3）LC-MS/MS检测。本发明专利技术的方法操作简便、定性定量能力较强，可作为检测酵米面质量和评估食品安全风险的可靠方法。

【技术实现步骤摘要】
一种毒黄素的液相色谱-串联质谱检测方法
本专利技术涉及一种毒黄素的液相色谱-串联质谱检测方法，属于仪器检测

技术介绍
椰毒伯克霍尔德氏(Burkholderiacocovenans)简称椰酵伯氏菌，是中国发现的一种新的食物中毒菌，它存在于谷类发酵制品(包括发酵玉米面、糯玉米汤圆粉、玉米淀粉等)、变质银耳、高粱米面制品、薯类制品(如马铃薯粉条、甘薯淀粉、山芋淀粉等)以及周围环境中，它是酵米面及变质银耳中毒的病原菌。该菌产生的毒素，对人和动物细胞具有毒性作用。一般的烹调方法不能破坏，通过消化道吸收散布到全身，潜伏期短，为20min～24h，患者开始感到胃部不适，全身无力，少数患者出现腹泻，但胃肠症状轻微；呕吐物多为咖啡色，严重者出现黄疸、昏迷、谵语、四肢抽搐、血尿、便血、肝大等症状，肝功能有明显改变。急性中毒者发病急，呈现中毒休克，平均病死率高达41.80％。椰酵伯氏菌产生两种毒素：米酵菌酸和毒黄素，是其致病原因。毒黄素(Toxflavin，TXF)是水溶性小分子脂肪酸类毒素，毒性极强，其化学毒性达到强毒化学品标准。毒黄素的分子式为C7H7N5O2，分子质量是193.17，结构为1,6—二甲基一5,7-二氧-1,5,6,7-四氢嘧啶基(5,4e)非对称三嗪。纯的毒黄素为亮黄色片状结晶，172-173℃分解，紫外吸收峰在256.7nm和394nm(ε＝16400，2500)。小鼠LD50静脉注射为l.7mg/kg，口服为8.4mg/kg。目前，关于毒黄素的研究主要集中在生理生化特性以及中毒解毒机制。有关毒黄素在食品中的提取和检测方法的研究尚属空白，因此建立一种快速可靠的酵米面中毒黄素的检测方法，对保证谷类米面食品的安全性，促进生产企业的技术创新，提高食品质量和档次，保障人民群众的身体健康具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种操作简便、定性定量能力较强的毒黄素的液相色谱-串联质谱检测方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供的毒黄素的液相色谱-串联质谱检测方法，包括下列步骤：(1)样品前处理准确称取经过粉碎、均质过的酵米面1.0g，用5mL超纯水溶液提取毒素，200rpm摇床震荡30min，20℃以下8000rpm离心10min，取上清液，以2mol/L甲酸调节上清液pH值至6～7；用5mL超纯水重复提取一次，合并两次上清液，用超纯水定容至10mL。此时得到较为纯净的粗提液。(2)富集和净化富集净化使用固相萃取柱，固相萃取柱为弱阳离子交换柱，带有弱阳离子交换作用机制的聚合物吸附剂，可以在高和低pH条件洗脱。粒径33μm，孔径85μm，表面积800m2/g，离子容量1.0meq/g。首先以1mL甲醇和1mL超纯水活化离子交换柱，活化过程流速控制在1-2滴/秒，取2mL粗提液注入离子交换柱进行净化富集，流速控制在1滴/秒，接着用1mL超纯水淋洗离子交换柱，以去除杂质，最后以1.0mL甲醇溶液分两次洗脱毒黄素，氮气吹至近干，以50％乙腈水溶液定容至0.4mL，待液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测；(3)LC-MS/MS检测液相条件PhenomenexGeminiC18色谱柱(3.0mm×150mm，5μm)，柱温30℃；进样量20μL；流动相A为水(含有0.1％甲酸，5mmol/L甲酸铵)，B为95％乙腈(含有0.1％甲酸，5mmol/L甲酸铵)；梯度洗脱条件见表1：表1梯度洗脱条件时间/min流速/μL·min-1A/％B/％0.025090103.025040603.0150040605.050040605.01250901010.02509010质谱条件离子化方式为电喷雾离子化负模式(ESI-)；多反应监测模式(MRM)；碰撞气压力(CAD)：6；气帘气压力(CUR)：10；电喷雾电压(IS)：-4500V；离子源温度(TEM)：600℃。化合物的多反应监测离子对及质谱相关参数如表2所示。表2化合物的多反应监测离子对及质谱相关参数表*为定量离子液相色谱-质谱检测时，由于基质效应的影响，导致目标化合物发生离子增强或抑制作用，采用不含目标待测物得基质空白溶液配制梯度混合标准品溶液(0.1，0.2，0.5，1.0，2.0mg/kg)。按照上述分析条件测定，以峰面积对浓度线性回归。超出线性范围的样品需要稀释后重新测定。标准曲线见图5、6。表3标准曲线及线性关系试样中毒黄素色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在±2.5％之内。毒黄素的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于3(S/N≥3)，定量离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于10(S/N≥10)。毒黄素的检测低限为0.2mg/kg。有益效果：本专利技术的方法操作简便、定性定量能力较强，可作检测酵米面质量和评估食品安全风险的可靠方法。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。图1为毒黄素的[M-H]-母离子质谱图。图2为毒黄素的[M-H]-为母离子产生的特征子离子碎片谱图。图3为毒黄素的总离子流图。图4为毒黄素的选择子离子流图。图5离子对192.1/107.8的标准曲线。图6离子对192.1/163.7的标准曲线。具体实施方式实施例1母离子的选择有关毒黄素的检测方法尚属空白，本专利技术比较了毒黄素的[M-H]-与[M-2H]2-二级碎片离子的响应值，结果表明毒黄素的[M-H]-离子作为母离子可以得到响应更强的二级离子碎片，本专利技术最终选择[M-H]-离子作为毒黄素母离子，其质谱检测灵敏度明显高于现有检测方法。毒黄素的母离子选择带一个负电荷的[M-H]-离子。图1为毒黄素的[M-H]-母离子质谱图。图2为毒黄素的[M-H]-为母离子产生的特征子离子碎片谱图。在对质谱参数进行优化后进行二级碎片扫描，发现毒黄素的[M-H]-离子作为母离子可以得到响应更强的二级离子碎片。毒黄素以[M-H]-离子作为母离子情况下，确定两对离子对，192.1/163.7和192.1/107.8；对以上两类离子对分别进行MRM优化和离子源优化后，在各自的最优条件下对相同浓度的MC-LR标准品进行液相色谱-串联质谱检测，通过对质谱图的比较分析，发现毒黄素以[M-H]-离子作为母离子情况下确定的两对离子对具有更强的响应值，灵敏度更高。实施例2样品前处理条件样品前处理本专利技术是以酵米面为基础，酵米面的基质比较复杂，富集净化前处理要求更高。准确称取经过粉碎、均质过的酵米面1.0g，用5mL超纯水溶液提取毒素，200rpm摇床震荡30min，20℃以下8000rpm离心10min，取上清液，以2mol/L甲酸调节上清液pH值至6～7；用5mL超纯水重复提取一次，合并两次上清液，用超纯水定容至10mL。此时得到较为纯净的粗提液。富集和净化首先以1mL甲醇和1mL超纯水活化离子交换柱，活化过程流速控制在1-2滴/秒，取2mL粗提液注入离子交换柱进行净化富集，流速控制在1滴/秒，接着用1mL超纯水淋洗离子交换柱，以去除杂质，最后以1.0mL甲醇溶液分两次洗脱毒黄素，氮气吹至近干，以50％乙腈水溶液定容至0.4mL，待液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测。实施例3LC-MS/MS检测条件的确定按照CAC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种毒黄素的液相色谱‑串联质谱检测方法，其特征在于，包括下列步骤：(1)样品前处理准确称取经过粉碎、均质过的待检测样品1.0g，用5mL超纯水溶液提取毒素，200rpm摇床震荡30min，20℃以下8000rpm离心10min，取上清液，以2mol/L甲酸调节上清液pH值至6～7；用5mL超纯水重复提取一次，合并两次上清液，用超纯水定容至10mL；得到纯净的粗提液；(2)富集和净化富集净化使用固相萃取柱，固相萃取柱为弱阳离子交换柱，粒径33μm，孔径85μm，表面积800m2/g，离子容量1.0meq/g；具体步骤是：首先以1mL甲醇和1mL超纯水活化离子交换柱，活化过程流速控制在1‑2滴/秒，取2mL粗提液注入离子交换柱进行净化富集，流速控制在1滴/秒，接着用1mL超纯水淋洗离子交换柱，以去除杂质，最后以1.0mL甲醇溶液分两次洗脱毒黄素，氮气吹至近干，以50％乙腈水溶液(v/v)定容至0.4mL，待液相色谱‑串联质谱(LC‑MS/MS)检测；(3)LC‑MS/MS检测液相条件Phenomenex Gemini C18反相色谱柱(3.0mm×150mm，5μm)，柱温30℃；进样量20μL；流动相A为水(含有0.1％甲酸(v/v)，5mmol/L甲酸铵)，B为95％乙腈(含有0.1％甲酸(v/v)，5mmol/L甲酸铵)；梯度洗脱；梯度洗脱条件如下：时间/min流速/μL·min‑1A/％B/％0.025090103.025040603.0150040605.050040605.01250901010.02509010质谱条件离子化方式为电喷雾离子化负模式(ESI‑)；多反应监测模式(MRM)；碰撞气压力(CAD)：6；气帘气压力(CUR)：10；电喷雾电压(IS)：‑4500V；离子源温度(TEM)：600℃；毒黄素的多反应监测离子对及质谱相关参数如下表：*为定量离子。...

【技术特征摘要】
1.一种毒黄素的液相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于，包括下列步骤：(1)样品前处理准确称取经过粉碎、均质过的待检测样品1.0g，用5mL超纯水溶液提取毒黄素，200rpm摇床震荡30min，20℃以下8000rpm离心10min，取上清液，以2mol/L甲酸调节上清液pH值至6~7；用5mL超纯水重复提取一次，合并两次上清液，用超纯水定容至10mL；得到纯净的粗提液；(2)富集和净化富集净化使用固相萃取柱，固相萃取柱为弱阳离子交换柱，粒径33μm，孔径85Å，表面积800m2/g，离子容量1.0meq/g；具体步骤是：首先以1mL甲醇和1mL超纯水活化离子交换柱，活化过程流速控制在1-2滴/秒，取2mL粗提液注入离子交换柱进行净化富集，流速控制在1滴/秒，接着用1mL超纯水淋洗离子交换柱，以去除杂质，最...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴振兴，赵华梅，吴兴海，静平，曹文卿，许艳丽，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：山东;37