本发明专利技术涉及一种分离富集并同时测定水环境中10种抗生素的方法，属于水环境中微量有机污染物质残留安全检测领域。其特征就是水样经固相萃取结合分散液液微萃取（SPE-DLLME）分离富集后，以超高液相色谱—质谱连用仪(UPLC-MS/MS)为检测工具，直接测定水环境（饮用水、自来水、河水、污水处理厂进出水）中10种常见抗生素的含量。这10种抗生素分别为磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、土霉素、四环素、多西环素、环丙沙星、左氧氟沙星、氯霉素、头孢呋辛酯和替硝唑。本发明专利技术对水样品前处理方法和仪器检测条件均进行了考察和优化，建立了最优的SPE-DLLME-UPLC-MS/MS方法，并成功运用于实际样品的测定。与传统方法相比，本方法具有灵敏度高，提取回收率高，适用对象广和对环境友好等优点。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】一种样品前处理技术结合液质联用测定水环境中?ο种抗 生素的方法
本专利技术涉及测定水中微量有机污染物的检测方法，特别地提供一种新的样品前处 理方式和灵敏的检测方式，具体来说是样品前处理技术结合液质联用技术直接测定水样中 10种常见抗生素的含量，属于水环境中微量有机污染物质残留安全检测领域。 【
技术介绍
】 抗生素主要是由细菌、霉菌或其他微生物产生的次级代谢产物或人工合成的类似 物，主要用于治疗各种细菌感染或致病微生物感染类疾病，为人类健康事业作出了巨大贡 献。但是，近年来抗生素滥用现象十分严重，卫生部曾表示，在中国，患者抗生素的使用率达 到70%，是欧美国家的两倍，但真正需要使用的不到20%。此外，抗生素的滥用除了体现在 医药行业外，也体现在畜牧业、水产养殖业及工业上。 抗生素的滥用给我国地表水造成了严重的污染。有报道称，已有68种抗生素在我 国的地表水环境中被检出，而且被检出抗生素的总体浓度水平与检出频率均较高，其中一 些抗生素在珠江、黄浦江等地的检出频率高达100%，有些抗生素检出的浓度高达每升几百 纳克，工业发达的国家则小于20纳克。这些在水环境中长期存在的抗生素会诱导微生物的 耐药性，并最终通过食物链对人类健康构成潜在威胁，控制水环境中的抗生素已刻不容缓。 样品的前处理是关系到分析结果准确性的关键步骤，有调查显示在整个色谱分析 过程中，30%的误差来源于样品前处理。由此可见，要保证分析结果的准确性，必须从样品 前处理技术入手。随着人们对于水环境中抗生素问题的日益重视，有关水环境中抗生素残 留检测的专利和论文已有公开发表。例如中国专利公开号CN101639466A公开了一种测定 水环境中磺胺和抗生素的SPE-HPLC方法；中国专利公开号CN101696964A公开了一种针对 水环境中氟喹诺酮的SPE-HPLC-荧光方法；中国专利公开号CN103336080A公开了一种测定 水环境中四环素的HLB-HPLC-MS/MS方法；中国专利公开号CN103278587A公开了一种针对 水环境中头孢的HLB-HPLC-MS方法等，这些方法的前处理方式主要是以固相萃取为主。水 环境中物染污物的种类多，存在形态各异，浓度较低而且环境基质比较复杂，采取固相萃取 为前处理方式，可以去除不需要的杂质，降低基质效应。但是，经固相萃取后，样品中待测物 的浓度在一定程度上会被稀释，这在一定程度上限制了其使用。 分散液液微萃取（DLLME)是由Rezaee等人于2006年首次提出的前处理方法，具 有操作简单，有机试剂用量少，富集倍数大等优点，但是其不适用于环境等复杂基质。 随着水安全标准的日益提高，对于能够快速、灵敏、准确地测定水源中尽可能多的 抗生素残留存在迫切需要，也是目前水环境领域中深入研究的重点课题之一。超高效液相 色谱-质谱法（UPLC-MS/MS)是21世纪初发展起来的一种分析技术，它是一种结合了UPLC 的高效分离能力与MS/MS的高灵敏度和极强专属性的分离检测技术，具有应用范围广、分 离能力强、灵敏度高、分析速度快和自动化程度高等特点，目前已成为有机物分析，特别是 药物分析的重要方法之一。 【
技术实现思路
】 本专利技术的目的旨在克服现有技术缺陷，提供一种同时测定水环境（饮用水、自来 水、河水、污水处理厂进出水）中10种不同结构抗生素的方法。本专利技术采用固相萃取结合分 散液液微萃取作为水环境样品的前处理技术，并利用超高液相色谱-质谱连用为检测器， 克服了现有方法有机试剂消耗大、干扰多以及检测限等问题，能够快速检测水环境中磺胺 嘧啶、磺胺甲恶唑、霉素、四环素、多西环素、环丙沙星、左氧氟沙星、氯霉素、头孢呋辛酯和 替硝唑10种抗生素的含量，适用对象广，测定结果灵敏，准确，干扰少。 本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的： -种分离富集并同时检测水环境中10种抗生素的方法，其具体步骤如下： 固相萃取-液液微萃取分离富集条件的优化 选择环境中常见的抗生素（磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、土霉素、四环素、多西环素、环 丙沙星、左氧氟沙星、氯霉素、头孢呋辛酯、替硝唑），采用单因素试验，对SPE-DLLME水中残 留抗生素进行条件考察，包括固相萃取小柱的种类、固相萃取pH值、洗脱剂种类、分散液液 微萃取萃取剂和分散剂的种类和用量等，选择最优的条件，得到在最优条件下对抗生素的 最大萃取率； 本专利技术包括如下步骤： (1)水样的预处理 采集、过滤后的水样加入金属螯合剂Na2-EDTA，用稀盐酸调节pH至3. 0-4. 0 ; (2)固相萃取（SPE)富集浓缩过程 依次用甲醇和等体积的纯水活化固相萃取小柱，将预步骤（1)中处理过的水样过 柱，富集，纯水淋洗，甲醇洗脱，洗脱液用氮气吹干，得残渣备用； (3)液液微萃取（DLLME)富集浓缩过程 将步骤（2)中得到的残渣用甲醇溶解，往该样品加入用稀盐酸调节的pH为 3. 0-4. 0的纯水，再分别加入二氯甲烷和体积比为1:1的分散剂甲醇-乙腈，涡旋，超声，离 心，去除上层水，下层有机相用氮气吹干，得残渣备用。 (4)超高液相-质谱联用测定水环境中10种抗生素 超高液相色谱分离 有机相为乙腈（B)，水相为体积比为0. 1%的甲酸水溶液（A)，采取梯度洗脱程序， 其梯度洗脱程序为〇_5min，流动相乙腈与0. 1 %甲酸-水的比例从30:70,改变为70:30;流 速为0· 2mL·min\柱温为35°C。 质谱检测 离子源为电喷雾离子化源（ESI源），源温度为120°C，锥孔电压：30V，提取离子电 压为3kV，毛细管电压为3kV，脱溶剂气温度：350°C，脱溶剂气流速为450L/hr，扫描时间： 0.ls，检测方式选择多反应离子检测（MRM); 精密量取乙腈-水（35:65)溶液100μL溶解步骤⑶中的残渣，涡旋后，用 0. 45μm滤膜过滤，得供试品，进样量10μL。 其中，步骤（1)中水样体积（mL)与金属螯合剂Na2-EDTA的用量（g)为：1000:1， 取水样250-500mL，加入螯合剂Na2-EDTA(0.lg/100mL水），所述的酸为稀盐酸； 步骤（2)中固相萃取小柱为聚合物填料萃取小柱，活化固相萃取小柱的甲醇和纯 化水的用量为：小柱体积的1-2倍，洗脱用甲醇的用量为：小柱体积的1-2倍； 步骤⑶中二氯甲烧、甲醇-乙腈（1:1)的用量分别为：700-900μL和 1100-1300yL； 祸旋时间：l_2min超声时间：4_6min离心转速：3000-5000rpm离心时间：5_8min 具体地，本专利技术可以采用如下方法制备： (1)水样的预处理 水样采集后封装冷冻，临用前解冻，过滤，其过滤方式为依次经双层定量滤纸过滤 1-4遍（根据水样洁净程度），0. 45μm滤膜过滤1遍；定量取过滤后的水样250-500mL，加 入金属螯合剂Na2-EDTA(0.lg/100mL水），用稀盐酸调节pH至3. 0-4. 0; (2)固相萃取（SPE)富集浓缩过程 依次用小柱体积1-2倍体积的甲醇和等体积的纯水活化聚合物填料萃取小柱， 将预步骤（1)中处理过的水样以5-10mL·min1过柱，富集完成后用小柱体积的1-2倍的 纯水淋洗并将小柱置于真空状态下干燥l〇本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种样品前处理技术结合液质联用测定水环境中10种抗生素的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)水样的预处理采集、过滤后的水样加入金属螯合剂，用酸调节pH至3.0‑4.0；(2)固相萃取富集浓缩过程依次用等体积的甲醇和纯水活化固相萃取小柱，将步骤(1)中处理过的水样过柱，富集，纯水淋洗，甲醇洗脱，洗脱液用氮气吹干，得残渣备用；(3)液液微萃取富集浓缩过程将步骤(2)中得到的残渣用甲醇溶解，往该样品加入pH为3.0‑4.0的水，再分别加入二氯甲烷和体积比为1:1的甲醇‑乙腈作分散剂，涡旋，超声，离心，去除上层水，下层有机相用氮气吹干，得残渣备用；(4)超高液相色谱‑质谱联用测定水环境中10种抗生素超高液相色谱分离有机相为乙腈(B)，水相为体积比为0.1％的甲酸水溶液(A)，采取梯度洗脱程序，流速为0.2mL·min‑1，柱温为35。质谱检测离子源为电喷雾离子化源(ESI源)，源温度为120℃，锥孔电压：30V，提取离子电压为3kV，毛细管电压为3kV，脱溶剂气温度：350℃，脱溶剂气流速为450L/hr，扫描时间：0.1s，检测方式选择多反应离子检测。将步骤(3)中的残渣用初始流动相复溶，过滤，进样；(5)10种抗生素含量测定结果的计算。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：梁宁，黄培婷，赵龙山，侯晓虹，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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