一种疏水层析制备高纯度藻红蛋白的方法技术

本发明专利技术提供了一种疏水层析制备高纯度藻红蛋白的方法。以新鲜紫球藻为原料,将藻泥与磷酸盐缓冲液按一定比例混匀后反复冻融5～7次，得到破壁液；将破壁液冷冻离心后取上清液，上清液用分子截留量为50～60kD的膜包超滤4～6次后，得到藻红蛋白粗提液；接着将藻红蛋白粗提液上样于疏水层析柱（Phenyl Sepharose Fast Flow）进行梯度洗脱，收集A545/A280>4.0的流出组分，冷冻干燥，得到纯化的藻红蛋白。本发明专利技术所采用的制备方法,纯化效果好，蛋白回收率高，工艺简便，具有较好的推广价值及应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于海洋生物活性物质制备
，具体的说是涉及一种疏水层析制备藻红蛋白的方法。
技术介绍
藻红蛋白(phycoerythrin，PE)是多种藻类的重要捕光色素蛋白，它与藻蓝蛋白(phycoeyanin，PC)、别藻蓝蛋白(allophycoeyanin，APC)等藻胆蛋白组成特殊的颗粒（藻胆体），起着吸收和传递光能的作用。藻红蛋白是由脱辅基蛋白和色基组成，其脱辅基蛋白是一类寡聚蛋白，基本单位为α和β亚基，有些藻红蛋白中还有少量的γ亚基。开环的四吡咯藻红素作为色基部分，由于色基的存在，藻红蛋白在可见光区480～570nm处有较强的光吸收，并且具有强烈的荧光。藻红蛋白用途非常广泛，它既可以作为天然色素应用于食品、化妆品等行业，还可制成荧光试剂，用于生物医学分析和免疫化学等领域。藻红蛋白也是一种重要的生理活性物质，具有抗肿瘤，抗病毒，增强免疫力等，它还是一种具有开发潜力的光敏剂，可制成光敏剂应用于肿瘤光动力学治疗。藻红蛋白的纯度通常用(A545/A280)来表示，等级划分为0.7<食品级<3.0<反应级<4.0<分析级，藻红蛋白的纯度越高，价格越高。目前人们主要采用硫酸按分级沉淀、羟基磷灰石柱层析、凝胶过滤层析等相结合的方法制备藻红蛋白，现有的制备工艺流程存在操作复杂、生产成本高、产品质量不稳定等缺陷，这些都严重制约了藻红蛋白的应用。
技术实现思路

技术实现思路
本专利技术就是针对上述问题，提供一种操作简便、生产成本低且能获得高纯度藻红蛋白的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的制备方案为：（1) 离心收集新鲜培养的紫球藻，将藻泥与磷酸盐缓冲液按1:5～1:10比例混合，得细胞悬液；（2) 将细胞悬液反复冻融5～7次，得到破壁液；将破壁液冷冻离心, 收集上清液；（3) 室温下将上清液超滤，收集滤液，得到藻红蛋白粗提液； (4) 将步骤(3)所得藻红蛋白粗提液上样于疏水层析柱，先用3～6倍磷酸盐缓冲液洗杂，再用蒸馏水洗脱，收集A545/A280>4.0的流出部分，冷冻干燥得到纯化的藻红蛋白。以上步骤所用的磷酸盐缓冲液pH为6.8～7.0，浓度为0.01～0.02mol/L；步骤(3)中所述的将上清液用分子截留量为50～60kD的膜包超滤，超滤4～6次；步骤(4)中所述的疏水层析介质为Phenyl Sepharose Fast Flow。本专利技术的有益效果：本专利技术采用疏水层析制备藻红蛋白的方法，操作方法简便易行，成本低廉，纯度高，回收率高，并且经过了实验室放大设备的验证。本专利技术采用了反复冻融、超滤以及加入疏水层析的方法，得到的藻红蛋白纯度A545/A280>4.0，为藻红蛋白应用于生物医学分析和免疫化学等领域奠定了基础。附图说明图1为本专利技术实施例提供的纯化后藻红蛋白的全波长扫描图图2为本专利技术实施例提供的纯化后藻红蛋白的SDS-PAGE电泳图（泳道1，标准蛋白；泳道2, 纯化的藻红蛋白）。具体实施方式实施例1（1) 离心收集新鲜培养的紫球藻10g，将藻泥与磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.02mol/L)按1:6比例充分混合，得细胞悬液；（2) 将细胞悬液置于-20˚C环境中冷冻完全，取出置于4˚C 温度下融化，至完全融化后再放置-20˚C环境中，如此反复冻融5次得到破壁液；将破壁液冷冻离心，收集上清液；（3) 室温下将上清液经分子截留量为60kD膜包超滤，超滤5次，收集滤液，得藻红蛋白粗提液； (4) 将步骤(3)所得藻红蛋白粗提液上样于疏水层析柱，先用6倍磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.02mol/L)洗杂，再用蒸馏水洗脱，收集A545/A280>4.0的流出部分(见图1和图2)，冷冻干燥得到纯化的藻红蛋白。从图1可以看出，藻红蛋白纯度（A545/A280）>4.0；纯化后的藻红蛋白的SDS-PAGE电泳图谱见图2，在分子量为30kD处的条带为γ亚基，在分子量为19kD处的条带为α和β亚基，由于这两种亚基的分子量接近，所以在图谱中出现了重叠现象，该结果与相关文献的报道一致。实施例2（1) 离心收集新鲜培养的紫球藻30g，将藻泥与磷酸盐缓冲液(pH 6.8，0.02mol/L)按1:5比例混合，得细胞悬液；（2) 将细胞悬液置于-20˚C环境中冷冻完全，取出置于4˚C 温度下融化，至完全融化后再放置-20˚C环境中，如此反复冻融6次得到破壁液；将破壁液冷冻离心，收集上清液；（3) 室温下将上清液经分子截留量为50kD膜包超滤，超滤6次，收集滤液，得藻红蛋白粗提液； (4) 将步骤(3)所得藻红蛋白粗提液上样于疏水层析柱，先用6倍磷酸盐缓冲液(pH 6.8，0.02mol/L)洗杂，再用蒸馏水洗脱，收集A545/A280>4.0的流出部分，冷冻干燥得到纯化的藻红蛋白，回收率为27.5%。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种疏水层析制备高纯度藻红蛋白的方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤：（1) 离心收集新鲜培养的紫球藻，将藻泥与磷酸盐缓冲液按1:5～1:10比例充分混匀，得细胞悬液；（2) 将步骤(1)所得细胞悬液反复冻融5～7次，得到破壁液；将破壁液冷冻离心, 收集上清液；（3) 室温下将步骤(3)所得上清液超滤后，收集滤液，得到藻红蛋白粗提液； (4) 将步骤(3)中的藻红蛋白粗提液上样于疏水层析柱，先用3～6倍磷酸盐缓冲液洗杂，再用蒸馏水洗脱，收集A545/A280>4.0的流出组分，冷冻干燥得到纯化的藻红蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种疏水层析制备高纯度藻红蛋白的方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤：（1) 离心收集新鲜培养的紫球藻，将藻泥与磷酸盐缓冲液按1:5～1:10比例充分混匀，得细胞悬液；（2) 将步骤(1)所得细胞悬液反复冻融5～7次，得到破壁液；将破壁液冷冻离心, 收集上清液；（3) 室温下将步骤(3)所得上清液超滤后，收集滤液，得到藻红蛋白粗提液； (4) 将步骤(3)中的藻红蛋白粗提液上样于疏水层析柱，先用3～6倍磷酸盐缓冲液洗杂，再用蒸馏水洗脱，收集...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐志红，赵吉路，鞠宝，
申请(专利权)人：烟台大学，
类型：发明
国别省市：山东;37