本发明专利技术描述了从包含两种类型的多肽二聚体的混合物分离或优选合成经由至少一个链间二硫键连接的二聚体与不经由至少一个链间二硫键连接的二聚体的方法。这些形式可利用疏水反应层析相互分离。此外，本发明专利技术涉及导致经由至少一个链间二硫键连接或不经由至少一个链间二硫键连接的二聚体的优先生物合成的连接肽。本发明专利技术还涉及组合物，其中大部分二聚体经由至少一个链间二硫键连接或不经由至少一个链间二硫键连接。本发明专利技术还涉及新的结合分子，例如，其包含本发明专利技术的连接肽。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请要求2003-6-27提交的题为“多肽的纯化和优选合成，”的USSN60/483877以及2003-10-3提交的题为“抗原结合多肽的纯化和优选合成，”的USSN 60/508,810的优先权。该申请还要求2003-10-28提交的题为“包含连接肽的修饰的抗体分子，”的USSN 60/515,351以及2003-10-30提交的题为“包含连接肽的修饰的抗体分子，”的USSN 60/516,030的优先权。该申请还与200406028提交的题为“包含连接肽的修饰的结合分子”的USSNXX/XXXXXX有关。这些申请的全文内容包含在本文作为参考。
技术介绍
抗体是二聚体分子；组成该二聚体的每个单体包含一条轻链和一条重链。抗体分子的溶液以两种与铰链异质性相关的形式存在。利用对纯化的Mab MAb的SDS-PAGE分析，通常这两种形式作为两条蛋白带即一条主要带(MW大约150-160kDa)和一条次要带(MW大约75-80kDa)而被观察到。该后一种形式通常在对纯化的IgG4制备物的SDS-PAGE分析之后观察到，但可在所有IgG同种型包括纯化的重组中MAb以低得多的频率得以鉴定(Angal etal.1993.Mol.Immunol.30105；Norderhaug et al.1990.Eur.J.Immunol.212370)。较大分子量的同种型，称为A型，含有位于对应Kabat编号系统位置239和242(位置226和229，EU编号系统)的共价链间二硫键(Kabat，E，Wu，TT，Perry，HM，Gottesman，KS，Foeller，CSequences of Proteins ofImmunological Interest.Bethesda，US Department of Health和人Services，NIH，1991)。第二种同种型B型，被认为不包含两条重链之间的共价连接以及两个相邻半胱氨酸残基之间的链间二硫键，如非还原性SDS-PAGE电泳中所见的75-80kDa证实的。推定B型的两条重链由与该分子的CH3结构域区域相关的强的非共价(即离子)相互作用来连接。A型和B型的混合物不存在于Mab片段的溶液中，所述片段含有完整铰链区，但缺乏CH3区，诸如F(ab)2片段。通常，遗传改造的或酶消化的F(ab)2Mab制备物缺乏B型，这是由于该分子缺乏保持非共价相互作用(例如氢键结合)所需的结构域。然而，它们存在于含有CH3区的Mab制备物中，诸如IgG4，CH2区缺失的Mab片段(例如，如02/060955 A2中所述)以及微型抗体(见例如，Hu et al.1996.CancerResearch 563055)以及IgG4分子中。将蛋白改造技术应用于治疗性抗体设计也产生出多种抗体模式，其具有改变的，在一些情况中具有改良的药效学、生物分布以及活性图谱。一些改变的抗体分子中，铰链区中的许多半胱氨酸残基被减少到一个，以促进抗体分子的聚集，因为半胱氨酸残基仅仅对于形成单个二硫键是必需的。这还提供了将铰链区附着于另一铰链区或者效应分子或报道分子的特异性靶(美国专利5,677,425)。抗体铰链中的半胱氨酸残基数目也增加(美国专利5,677,425)。其它突变的抗体被构建，其中IgG1铰链区和CH2结构域用人IgG3铰链区替换(WO 97/11370)。这些分子含有11个巯基用于经由硫醇基替换多个半抗原。CH2结构域缺失的抗体的分子量约为120kDa，并且显示与全长IgG相比，其穿透肿瘤的能力明显更好。微型抗体，其也缺失CH2结构域，具有相似的性质。这些结构域缺失的分子在肿瘤位点的聚集比其它Mab片段诸如F(ab)′2更为有效，但不具有利用完整IgG抗体时所见的不利药效学图谱。CH2结构域缺失的抗体由以下部分组成VLCL轻链和VH1重链结构域以及与CH3结构域基因融合(直接和经由合成肽间隔物)的部分铰链区(例如，上和中铰链)。例如，重组CH2结构域缺失的ddCC49的合成，识别各种人癌症上表达的肿瘤相关的TAG72抗原的结构域缺失的抗体，在细胞培养物中产生大约50∶50分布的A和B同种型。改造为表达其它形式的CH2结构域缺失的抗体，所述抗体例如四价CH2结构域缺失的抗体，微型抗体，或四价微型抗体的细胞也表达A和B同种型和/或单体半-体(mer)分子组成的混合物。即使在Mab纯化以后，A型和B型也极难分离，这是由于它们由相同的氨基酸组成，由此具有相同的分子量和类似的物理和化学性质。它们不能通过通常用于纯化抗体分子包括重组MAb蛋白的标准凝胶过滤，亲和层析，和离子交换层析来分离。目前的生产工艺丢弃所产生总抗体的至少50％，这对总产率具有负面影响。此外，两种同种型的存在增加下游加工所需的努力。因此，分离A型和B型的方法或增加一种或另一种形式的抗体的生物合成的方法非常有益。
技术实现思路
本专利技术至少部分基于以下发现在包含含有不同同种型的二聚体多肽分子(包含两个重链部分的分子，其中部分分子包含经由至少一个链间二硫键(A型)连接的两个重链部分，部分分子包含不经由至少一个链间二硫键连接的两个重链部分(B型))混合物的组合物中，一种形式或另一种可优选获得，例如通过利用疏水作用层析分离或通过包含导致A型或B型的优选生物合成的合成连接肽。本专利技术的连接肽可包含在倾向于形成A型和B型的任何二聚体分子中，例如抗体分子，结构域缺失的抗体分子(例如缺乏所有或部分CH2结构域)，微型抗体，二价抗体，融合蛋白等。在优选的实施方案中，A型的形成被增强。A型多肽二聚体在体外显示增强的稳定性，在体内显示增强的生物分布。因此，一方面，本专利技术涉及组合物，其包含具有至少两个结合位点和至少两条多肽链的多肽二聚体，其中所述至少两条多肽链包含至少一个重链部分和合成连接肽，其中超过50％的所述多肽二聚体经由至少一个链间二硫键连接。一个实施方案中，超过90％的所述多肽二聚体经由至少一个链间二硫键连接。一个实施方案中，所述多肽链包含经由连接肽基因融合于VL，VH或CH1的CH3结构域。一个实施方案中，所述多肽链缺乏所有或部分CH2结构域。一个实施方案中，所述多肽二聚体经由两个或多个链间二硫键连接。一个实施方案中，所述重链部分源自选自下组的抗体同种型IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4。一个实施方案中，所述重链部分包含源自选自下组的铰链区的氨基酸序列γ1铰链，γ2铰链，γ3铰链，或γ4铰链。一个实施方案中，其中所述重链部分包含嵌合铰链。一个实施方案中，所述合成连接肽包含至少部分IgG1铰链结构域，至少部分IgG3铰链结构域。一个实施方案中，所述结合位点独立选自以下组抗原结合位点，受体的配体结合部分，或配体的受体结合部分。一个实施方案中，所述多肽二聚体包含四条多肽链。另一实施方案中，所述多肽链中有两条包含至少一个重链部分和合成连接肽。另一方面中，本专利技术涉及组合物，其包含具有至少两个结合位点和至少两条多肽链的多肽二聚体，其中所述至少两条多肽链包含至少一个重链部分和合成连接肽，其中超过约50％的所述多肽二聚体经由至少一个链间二硫键连接，其中所述连接肽包含位于Kabat编号系统的位置243的脯氨酸残基。一个实施方案中，超过90％的所述多肽本文档来自技高网...
【技术保护点】
组合物，其包含具有至少两个结合位点和至少两条多肽链的多肽二聚体，其中所述至少两条多肽链包含至少一个重链部分和合成连接肽，其中超过５０％的所述多肽二聚体包含经由至少一个链间二硫键连接的多肽链。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：加里R布拉斯拉夫斯基，斯科特格拉泽，杨祖宏，珍妮弗霍普，保罗钦，
申请(专利权)人：比奥根艾迪克MA公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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