本发明专利技术公开了一种大容量的疏水电荷诱导色谱介质的制备方法，属于生化工程领域中的蛋白质色谱分离技术。该色谱介质为间隔臂末端偶联咪唑化合物作为色谱配基。其制备方法为将琼脂糖凝胶介质中依次加入二甲基亚砜、环氧氯丙烷和氢氧化钠溶液后活化介质；活化后的介质在碱性的二甲基亚砜溶液中与咪唑化合物配基偶联；最后介质表面残余的环氧基经还原后得到所需的色谱介质。该色谱介质对蛋白质的吸附容量达到８０ｍｇ／ｍｌ湿介质且在较宽的离子强度范围（０．１－１．０ｍｏｌ／Ｌ）内维持相对恒定；同时，依靠ｐＨ在４．０－６．０间的调节完成蛋白质洗脱的模式更加温和，由此在蛋白等生物大分子分离纯化中将有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种大容量的疏水电荷诱导色谱介质及其制备方法，属于生化工程领域中 的蛋白质色谱分离技术。
技术介绍
近年来，随着生物技术的发展，那些与人类健康密切相关的蛋白质得以通过基因重组 技术而批量生产。这种借助基因工程菌规模化批量生产蛋白质所获得的产物中不仅含有目 标产品，也包括大量宿主细胞自身发育生长中产生的杂蛋白。同时，广泛采用的高密度发 酵技术以提供更为丰富的碳、氮及无机盐离子为前提实现目标产物的高收率。与此同时， 那些残留在发酵液中的营养物质也使得目标产物处于更加复杂的环境中，从而加剧了生物 下游加工过程的难度。因此，高效而经济地从发酵液中收获蛋白质，便成为大规模分离纯 化设计的关键。色谱技术被广泛地应用于蛋白质分离纯化过程中。蛋白质纯化过程中常用的色谱技术 包括凝胶过滤色谱、离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、亲和色谱等。这些色谱在操作 中对于料液的离子强度有一定的要求。以离子交换色谱为例，色谱介质对蛋白质的吸附通常在较低的离子强度(20 50 mmol/L)下进行；与之相反，蛋白质在疏水性相互作用色 谱中的吸附则主要发生在高离子强度(>500mmol/L)下。这样的色谱过程往往需要增 加预处理及后处理步骤，完成对料液离子强度的调节。这不仅增加生产成本p且造成蛋白 质的稳定性下降。因此，降低色谱过程对离子强度的依赖性就能减少相关的辅助步骤，简 化生物下游加工过程工艺，縮短蛋白质提取的周期，提高工艺流程的经济性。1996年，Burton和Harding公开了一种以可离子化基团为配基的疏水性相互作用色 谱分离技术(CA2193867)。该色谱与通常疏水性相互作用色谱最大的区别在于蛋白质 的吸附容量与离子强度无关；吸附蛋白质的洗脱通过调节液相pH值实现。当液相pH降低 时，离子化的配基与被吸附的蛋白质由于带同种电荷而产生静电排斥作用，蛋白质从色谱 介质上解吸。据此，该色谱又被称为疏水电荷诱导色谱或者混合模式色谱。Kasche等人 利用偶合苯基丁胺配基的色谱介质实现了蛋白质的快速分离(J Chromatogr, 510: 149, 1990),但其对亲水性蛋白的吸附作用十分有限，通常需要在高离子强度下进行。1998年，Biosepra公司公开了一种同样基于疏水电荷诱导色谱原理的拟亲和色谱，该色谱介质以 含巯基的杂环化合物为配基(US Patent 5719269)。但该色谱介质的应用范围仅限于抗 体的提纯。近来，其它针对抗体分离而特定设计的色谱介质专利还有US Patent 6498236 及US Patent 2007112178。 2007年，孙彦等人公开了一种含有吲哚基团的疏水电荷 诱导色谱介质(申请号200710056591.4)。该色谱介质采用了非盐依赖性配基，可直 接从料液中捕获蛋白质且洗脱条件相对温和。目前，疏水电荷诱导色谱已引起了广泛地关 注，但配基的选择仍然是当前急待解决的问题。与传统蛋白质色谱方法相比，疏水电荷诱 导色谱仍然存在吸附容量低且洗脱条件也较传统色谱方法更为苛刻等缺陷。因此，开发适 合于HCIC方法的配基对于HCIC的商业化进程具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于开发一种大吸附容量的疏水电荷诱导色谱介质及其制备方法。所述 的色谱介质在拥有较高吸附容量的同时，可以通过更加温和的、接近生理的洗脱条件加以 回收。所述的制备方法简单、易于放大。本专利技术是通过下述技术方案加以实现的。 一种大吸附容量的疏水电荷诱导色谱介质， 其特征在于，该色谱介质是在平均粒径为30-300 |jm的琼脂糖凝胶颗粒的介质表面偶联 环氧基，环氧基间隔臂末端偶联咪唑化合物X为介质的配基,色谱介质结构形式表达如下，咪唑化合物X结构式如I式所示，<formula>formula see original document page 5</formula>其中Rl-R4中的一个基团必为氨基或含有l-4个碳原子的短链垸基氨，其余的基 团为氢原子或为含有1-4个碳原子的短链烷烃。上述的咪唑化合物选自2-氨基咪唑、(R)-a-甲基咪唑、组胺、4-甲基组胺、3-甲基 组胺、4-氨甲基咪唑和5-甲基-4-氨甲基咪唑。上述的色谱介质的制备方法，其特征在于包括以下过程1. 介质的活化将平均粒径为30-300 |jm的琼脂糖凝胶颗粒的介质抽干后，倒入二甲基亚砜溶液中， 二甲基亚砜的体积用量为介质体积量的0.5-10倍，制得介质悬浮液，继而向介质悬浮液 中加入体积用量为介质体积量的0.2-6倍的环氧氯丙烷，制得介质混合悬浮液，向介质混 合悬浮液中加入浓度为0.1-2.0 mol/L、体积用量为介质悬浮液体积量的0.1-5倍的氢 氧化钠溶液，之后于15-60 。C的水浴中活化0.3-10小时，滤出介质用去离子水冲洗至 无游离的环氧基团检出后抽干水分，得到活化介质。2. 活化介质的偶联配基将活化介质再悬浮于含有咪唑化合物的磷酸氢二钠溶液中，磷酸氢二钠溶液中的咪唑 化合物的浓度按每克活化介质用量0.02-10 mmol计，再将该活化介质的磷酸氢二钠悬 浮液于25-70 °C下反应2-20小时完成配基的偶联，收集偶联配基介质经去离子水清洗 后，将偶联配基介质悬浮于0.2-1.0 g/L硼氢化钠中反应10-18小时还原介质表面残留 的环氧基团，从而得到大吸附容量的疏水电荷诱导色谱介质。上述的介质活化过程中，二甲基亚砜的体积用量为凝胶介质体积量的1-5倍，环氧氯 丙垸的体积用量为凝胶介质体积量的0.4-4倍，氢氧化钠浓度为0.4-1.4 mol/L，体积 用量为介质悬浮液体积量的0.4-2倍，活化反应温度为30-50 。C和反应时间为1-4小 时；上述的活化介质的偶联配基过程中，磷酸氢二钠溶液中的咪唑化合物的浓度按每克活 化介质需0.2-5 mmol计，偶联反应温度为35-60 。C和反应时间为4-12小时；偶联 配基介质在0.3-0.8 g/L硼氢化钠中反应还原介质表面残留的环氧基团。本专利技术的关键技术有五点首先是配基的选择方式，通过计算机虚拟筛选从近20万 的化合物分子库中筛选获得疏水性适中、可在接近中性环境中弱解离的咪唑化合物为配 基，并通过对配基与蛋白质分子的对接获得候选的配基；其次是环氧氯丙烷活化条件的选 择，在水溶液中环氧氯丙烷的活化作用受到其在水中溶解度的限制而难以获得提高，本发 明通过引入亲水性有机溶剂二甲基亚砜，促进了环氧氯丙烷的溶解度和均相反应体系的形 成，同时偶联介质中残留的环氧基团经还原处理后生成羟基，不会产生非特异性吸附；关 键之三配基偶联过程中配基的加入量，配基加入量的增加有利于提高配基的修饰密度，但过量配基的加入会徒赠合成的成本；关键之四配基偶联条件的选择，适当的偶联温度及反 应时间可有效地提高配基在介质表面的偶联效率，而偶联步骤中液相的体积的控制也可获 得高配基修饰密度的介质；最后是采用适当的还原步骤处理残留的环氧基团，避免色谱介 质的非特异吸附及其对后续其它操作的影响。本专利技术提供的大容量的疏水电荷诱导色谱介质材料，该色谱介质具有如下显著特点-偶联配基的色谱介质对主要的模型蛋白质均有较高的吸附容量且吸附容量在较宽的离子强度范围(0.1-1.0 mol/L)内维本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种大吸附容量的疏水电荷诱导色谱介质，其特征在于，该色谱介质是在平均粒径为３０－３００μｍ的琼脂糖凝胶颗粒的介质表面偶联环氧基，环氧基间隔臂末端偶联咪唑化合物Ｘ为介质的配基，色谱介质结构形式表达如下， ＊＊＊ 咪唑化合物Ｘ结构式如Ⅰ式所示， ＊＊＊ Ⅰ 其中：Ｒ１－Ｒ４中的一个基团必为氨基或含有１－４个碳原子的短链烷基氨，其余的基团为氢原子或为含有１－４个碳原子的短链烷烃。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：史清洪，沈芳芳，孙彦，白姝，董晓燕，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]
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