具有提高的L-苏氨酸生产能力的微生物以及使用其生产L-苏氨酸的方法技术

本发明专利技术涉及新型变体RNA聚合酶σ因子70(σ70)多肽、编码其的多核苷酸、含有该多肽的微生物以及使用该微生物生产L‑苏氨酸的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种新型变体RNA聚合酶σ因子70(σ70)多肽、编码其的多核苷酸、含有该多肽的微生物、以及使用该微生物生产L-苏氨酸的方法。
技术介绍
通常，有用的产物诸如氨基酸可以通过使用经由人工突变或遗传重组开发出的微生物菌株的发酵方法来生产。特别是，在开发用于大规模生产氨基酸的微生物菌株中，发现直接/间接参与生产的更高级联步骤(cascade step)的遗传因子，并适当地利用它们来开发能够产生更高收率的微生物菌株将是有利的。在此方面的代表性技术可以是全局转录机器工程(gTME)，其可以通过在RNA聚合酶的招募蛋白质上引起随机突变来调控所有细胞内基因的表达。RNA聚合酶是由五种亚基2α、β、β’和ω组成的大分子，并且其全酶表示为α2ββ'ω。同这些全酶一起，σ因子——存在于原核生物中的转录起始因子——可以允许RNA聚合酶与启动子特异性结合，并且可以通过其分子量进行区分。例如，σ70代表分子量为70kDa的σ因子(Gruber TM,Gross CA,Annu Rev Microbiol.57:441-66,2003)。已知大肠杆菌(Escherichia coli)具有持家σ因子σ70(RpoD)、氮限制σ因子σ54(RpoN)、饥饿/稳定期σ因子σ38(RpoS)、热激σ因子σ32(RpoH)、鞭毛σ因子σ28(RpoF)、胞质外/极端热应力σ因子σ24(RpoE)、柠檬酸铁σ因子σ19(FecI)等。已知这些不同σ因子在不同的环境条件下被激活，并且这些特征σ因子可以与在特定环境条件下转录的基因的启动子结合，从而调控基因的转录。已经报道了关于通过在σ因子70上允许随机突变来增加目标物质生产力的研究(Metabolic Engineering 9.2007.258-267)，并且还有关于在大肠杆菌(E.coli)中使用gTME技术增加酪氨酸生产的研究报道(美国专利第8735132号)。
技术实现思路
技术问题本专利技术人，在努力开发能够以提高的浓度生产L-苏氨酸而不使宿主细胞生长阻滞的微生物时，开发了一种新型经修饰的RNA聚合酶σ因子70多肽，并且还发现可以通过将新型经修饰的RNA聚合酶σ因子70多肽导入到具有L-苏氨酸生产能力的埃希氏菌属(Escherichia sp.)中开发具有提高的L-苏氨酸生产能力的细菌菌株。技术方案本专利技术的目的是提供具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的RNA聚合酶σ因子70活性的经修饰的多肽，其中一部分氨基酸被取代。本专利技术的另一目的是提供编码该多肽的多核苷酸。本专利技术的另一目的是提供包括该多肽的转化微生物。本专利技术的又一目的是提供生产L-苏氨酸的方法，所述方法包括培养该微生物；和从培养的微生物或者其培养基中回收L-苏氨酸。有利效果本专利技术实现了能够上调L-苏氨酸生产能力的RNA聚合酶σ因子70多肽的新型变体的确认。此外，基于其的能够表达经修饰的多肽的微生物具有L-苏氨酸生产的优异收率，并且，因此从工业的角度来看，该微生物可以提供生产便利、以及生产成本的降低。具体实施方式在上述目的方面中，本专利技术提供具有RNA聚合酶σ因子70活性的新型经修饰的多肽。如本文所使用的，术语“RNA聚合酶σ因子70”是指蛋白质σ70—σ因子中的一种，并且被称为σ因子D(RpoD)。同RNA聚合酶一起，蛋白质σ70充当转录起始因子中的一种。σ因子通过与特定启动子和不同转录因子上游上的上游DNA(UP元件)相互作用来参与转录的调控。具体而言，σ因子70(σ70)是大肠杆菌σ因子中的主要调节子，其控制着大多数持家基因和核心基因，并且已知在大肠杆菌指数期起主导作用(Jishage M等人,J Bacteriol 178(18)；5447-51,1996)。可从已知数据库(如NCBI GenBank)中获得关于σ因子70蛋白质的信息，例如，其可以是具有登录号NP_417539的蛋白质。具体地，σ70蛋白质可包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列，但并不限于此，只要蛋白质具有与本专利技术的σ70蛋白质相同的活性。如本文所使用的，术语“经修饰的多肽”通常是指其中多肽的部分或全部氨基酸序列被取代的野生型多肽。在本专利技术中，它指代的是具有RNA聚合酶σ因子70(σ70)活性的多肽，其具有与野生型部分不同的氨基酸序列，通过取代野生型σ因子70(σ70)的部分氨基酸序列而制得，即，有助于增强L-苏氨酸生产能力的σ因子70(σ70)经修饰的多肽具体地，经修饰的多肽可以是具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的RNA聚合酶σ因子70活性的多肽，其中在440至450；459；466；470至479；484；495至499；509；527；565至570；575至580；599；和612位置(自作为第一氨基酸的初始甲硫氨酸起)处的至少一个氨基酸被另一个氨基酸取代。即，经修饰的多肽可以是这样的多肽：其中在45个位置(位置440至450、459、466、470至479、484、495至499、509、527、565至570、575至580、599和612)的至少一个中的氨基酸可被另一个氨基酸取代。例如，位置的个数可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多，但并不限于此，只要其具有RNA聚合酶σ因子70的活性。更具体地，在那些处于位置440至450中的位置440、446或448处的氨基酸；在那些处于位置470至479中的位置474或477处的氨基酸；在那些处于位置495至499中的位置496或498处的氨基酸；在那些处于位置565至570中的位置567或569处的氨基酸；以及在那些处于位置575至580中的位置576或579处的氨基酸可被另一个氨基酸取代，但并不限于此。进一步更具体地，在位置440处的氨基酸可被脯氨酸取代(T440P)；在位置446处的氨基酸可被脯氨酸取代(Q446P)；在位置448处的氨基酸可被丝氨酸取代(R448S)；在位置459处的氨基酸可被天冬酰胺取代(T459N)；在位置466处的氨基酸可被丝氨酸取代(I466S)；在位置474处的氨基酸可被缬氨酸取代(M474V)；在位置477处的氨基酸可被甘氨酸取代(E477G)；在位置484处的氨基酸可被缬氨酸取代(A484V)；在位置496处的氨基酸可被天冬酰胺取代(K496N)；在位置498处的氨基酸可被精氨酸取代(L498R)；在位置509处的氨基酸可被甲硫氨酸取代(T509M)；在位置527处的氨基酸可被脯氨酸取代(T527P)；在位置567处的氨基酸可被缬氨酸取代(M567V)；在位置569处的氨基酸可被脯氨酸取代(T569P)；在位置576处的氨基酸可被甘氨酸取代(N576G)；在位置579处的氨基酸可被精氨酸(Q579R)、亮氨酸(Q579L)、苏氨酸(Q579T)、异亮氨酸(Q579I)、甘氨酸(Q579G)、丙氨酸(Q579A)、脯氨酸(Q579P)或丝氨酸(Q579S)取代；在位置599处的氨基酸可被半胱氨酸取代(R599C)；或位置612处的氨基酸可被甘氨酸(D612G)、酪氨酸(D612Y)、苏氨酸(D612T)、天冬酰胺(D612N)、苯丙氨酸(D612F)、赖氨酸(D612K)、丝氨酸(D612S)、精氨酸(D612R)或本文档来自技高网...

【技术保护点】
经修饰的多肽，其具有RNA聚合酶σ因子70的活性，其中在SEQ ID NO:8的氨基酸序列中在自作为第一氨基酸的甲硫氨酸起440至450；459；466；470至479；484；495至499；509；527；565至570；575至580；599；和612位置处的至少一个氨基酸被另一个氨基酸取代。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.05 KR 10-2014-01191381.经修饰的多肽，其具有RNA聚合酶σ因子70的活性，其中在SEQ ID NO:8的氨基酸序列中在自作为第一氨基酸的甲硫氨酸起440至450；459；466；470至479；484；495至499；509；527；565至570；575至580；599；和612位置处的至少一个氨基酸被另一个氨基酸取代。2.根据权利要求1所述的经修饰的多肽，其中在440；446；448；459；466；474；477；484；496；498；509；527；567；569；576；579；599；和612位置处的至少一个氨基酸被另一个氨基酸取代。3.根据权利要求1所述的经修饰的多肽，其中所述取代是选自以下的至少一种取代或其组合：在位置440处的氨基酸被脯氨酸取代；在位置446处的氨基酸被脯氨酸取代；在位置448处的氨基酸被丝氨酸取代；在位置459处的氨基酸被天冬酰胺取代；在位置466处的氨基酸被丝氨酸取代；在位置474处的氨基酸被缬氨酸取代；在位置477处的氨基酸被甘氨酸取代；在位置484处的氨基酸被缬氨酸取代；在位置496处的氨基酸被天冬酰胺取代；在位置498处的氨基酸被精氨酸取代；在位置509处的氨基酸被甲硫氨酸取代；在位置527处的氨基酸被脯氨酸取代；在位置567处的氨基酸被缬氨酸取代；在位置569处的氨基酸被脯氨酸取代；在位置576处的氨基酸被甘氨酸取代；在位置579处的氨基酸被精氨酸、亮氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸或丝氨酸取代；在位置599处的氨基酸被半胱氨酸取代；和在位置612处的氨基酸被甘氨酸、酪氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、组氨酸或终止密码子取代。4.根据权利要求1所述的经修饰的多肽，其中所述经修饰的多肽具有选自SEQ ID NOS:9至37的氨基酸序列的氨基酸序列。5.多核苷酸，其编码权利要求1所述的经修饰的多肽。6.宿主细胞，其包括权利要求5...

【专利技术属性】
技术研发人员：李知宣，李光镐，金孝珍，李根喆，黄荣彬，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR