本发明专利技术属医药技术领域，具体涉及一种哈萨克药金莲花抗肿瘤提取物及其组合物的制备方法和其在制备预防及治疗乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、脑胶质瘤、肝癌等恶性肿瘤药物中的应用。本发明专利技术的提取物通过如下方法制备：哈萨克药金莲花经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100：1-100:6，体积比）洗脱，继用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100：8-100:30，体积比）洗脱，石油醚：丙酮100：8-100:30洗脱液干燥后即得。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属医药
，具体涉及一种哈萨克药金莲花抗肿瘤提取物及其组合物的制备方法和其在制备预防及治疗肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、脑胶质瘤等恶性肿瘤药物上的用途。
技术介绍
本品是毛茛科金莲花属的植物，学名：Trollius chinensis Bunge。一年生或多年生草本。株高30－100厘米。茎柔软攀附。叶圆形似荷叶，花形近似喇叭，萼筒细长，常见黄、橙、红色。有变种矮金莲，株形紧密低矮，枝叶密生，株高仅达30厘米，极适宜盆栽观赏，花期2－5月。是很好的装饰用花卉，也可构成窗景。金莲花具药用功能，可清热解毒，主治扁桃体炎、中耳炎。用于急、慢性扁桃体炎，急性中耳炎，急性鼓膜炎，急性结膜炎，急性淋巴管炎。本专利技术通过系统地筛选研究，意外地发现金莲花提取物具有显著抗肿瘤活性，即金莲花提取物对乳腺癌、宫颈癌、肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、脑胶质瘤等恶性肿瘤的具有很好的预防及治疗作用，可以应用于癌症的预防和治疗。但是，对其抗肿瘤的有效成分一直不清楚，本专利技术通过系统地筛选研究，发现了金莲花的有效提取提取物，可以应用于肿瘤的预防和治疗。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题是提供一种金莲花提取物。本专利技术还提供了以金莲花提取物为主要活性成分的组合物。本专利技术同时提供了金莲花提取物及其组合物的制备和制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术是通过如下技术方案实现的：哈萨克药金莲花经有机溶剂(优选甲醇)超声提取，提取液浓缩后，用硅胶SiO2柱分离，上样后的硅胶柱，用石油醚：丙酮混合溶剂(100：0-0：100)梯度洗脱(石油醚：丙酮，具体比例见表1)，各石油醚：丙酮比例混合溶剂洗脱液，浓缩，干燥后，利用体外抗肿瘤活性筛选体系测试其抗肿瘤活性，意外地发现先用石油醚：丙酮混合溶剂(石油醚：丙酮，100：1-100:6，体积比，优选100：4-100：6)洗脱，继用石油醚：丙酮混合溶剂(石油醚：丙酮，100：8-100:30，体积比)洗脱，石油醚：丙酮100：8-100:30洗脱液干燥后，具有显著地抗肿瘤活性。优选地，先用石油醚：丙酮混合溶剂(石油醚：
丙酮，100:6，体积比，继用石油醚：丙酮混合溶剂(石油醚：丙酮，100:30，体积比)洗脱，石油醚：丙酮100:30洗脱液干燥即得，本专利技术的抗肿瘤活性的化合物，可以通过以上方法，得到富集，从而与其他杂质类成分分离开。该活性提取物从未见文献报道，其100：30洗脱液的TLC分析表征如图1。色谱条件为GF254硅胶板，展开系统是石油醚：乙酸乙酯：丙酮＝3:1:1，香草醛浓硫酸显色。具体，发现过程如下：1、金莲花经甲醇超声提取物的制备取哈萨克药金莲花20g，经100ml甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，得提取物SN0244A：1.9763g留样0.0980g、0.0989g剩余1.7794g2、石油醚：丙酮混合溶剂梯度洗脱方法和结果取哈萨克药金莲花20g，经100ml甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，得提取物SN0244A：1.9763g留样0.0980g、0.0989g剩余1.7794g。上柱，甲醇溶解，共用甲醇15ml。上硅胶柱色谱，拌样硅胶2.5g,空白硅胶10g,玻璃柱内径1.8cm，石油醚：丙酮系统梯度洗脱(石油醚：丙酮，体积比，见表1)，柱体积25ml，每个梯度洗脱200ml，得到，各个浓度提取洗脱液的洗脱物，回收溶剂，即得，石油醚：丙酮梯度洗脱提取物，TLC分析结果见图2，图3。色谱条件为GF254硅胶板，展开系统是石油醚：乙酸乙酯：丙酮＝6:1:1，石油醚：乙酸乙酯：丙酮＝3:1:1，香草醛浓硫酸显色。表13、抗肿瘤活性筛选方法和结果1)实验条件a)细胞株信息人乳腺癌细胞株MCF7购于中国典型培养物保藏中心细胞库。b)药品及试剂样品无菌条件下，DMSO溶解配置成母液浓度为100mg/mL，使用时用RPMI-1640培养液稀释至所需浓度(DMSO≤1‰)。RPMI Medium 1640培养基干粉购于美国GIBCO公司。胎牛血清购于北京元亨圣马生物技术研究所。Trypsin 1:250、二甲基二苯基四氮唑溴盐(MTT)。c)仪器CO2培养箱(SANYO，日本)垂直层流洁净工作台(上海上净净化设备有限公司)倒置生物显微镜(重庆光电仪器有限公司)低/高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)电子天平(奥豪斯仪器有限公司)酶标仪(伯乐生命医学产品有限公司)立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂)PH计(SARTORIUS，德国)2)实验方法和过程人乳腺癌细胞株MCF7以4000/孔的密度铺于96孔板，每孔100ul，12h后使用。各组分以DMSO溶解为100mg/mL储存液，保存于-20℃待用。铺板后12h，观察细胞汇合率约为40％，加药，浓度均为100μg/mL，每个组分3个复孔。每板细胞设立二个对照组(培养基+细胞；含0.1％DMSO培养基+细胞)，3个空白孔(只有培养基)。加入药物24小时后，加入20μl四甲基偶氮唑盐化学名为3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-dimethyl-2thiazolyl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide，MTT)，继续培养4小时。完全
弃去上清液，加入100μl DMSO，混匀使MTT完全溶解，去气泡。490nm测定OD值。3)实验结果表2结果发现：本专利技术优选如下方案：哈萨克药金莲花经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱
分离，上样后的硅胶柱，先用石油醚：丙酮混合溶剂(石油醚：丙酮，100:6，体积比)洗脱，继用石油醚：丙酮混合溶剂(石油醚：丙酮，100:30，体积比)洗脱，石油醚：丙酮100:30洗脱液经回收有机溶剂，干燥，得到高活性提取物，即为该抗肿瘤的提取物。该活性提取物从未见文献报道，其TLC分析表征如图1。4、抗肿瘤有效提取物的提取方法研究1)提取溶剂的种类研究分别用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、丙酮、甲醇水混合溶剂、乙醇水混合溶剂等有机溶剂提取，并测试提取物的对MCF7细胞的抗肿瘤活性，结果如下：表3研究结果表明：提取用溶剂可以为甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、丙酮、甲醇水混合溶剂、乙醇水混合溶剂。2)提取溶剂的用量研究分别用1、2、5、10、20、30、40、50倍(重量/体积比)有机溶剂提取，并测试提取物的抗肿瘤活性，结果如下：表4金莲花不同溶剂、溶剂用量提取物的收率及其对MCF7细胞的抑制活性提取物提取用有机溶剂用量为药材重量的2-50倍(重量/体积比)。3)干燥方法的研究分别用真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法等方法，对得到的抗肿瘤活性提取物进行干燥，以含水量、TLC、活性测试为指标，发现真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法适用于对MCF7细胞抗肿瘤活性提取物进行干燥，其中，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。表5样品20g真空干燥法冷冻干燥法鼓风干燥法离心干燥法旋蒸干燥法含水量(％)8.78.610.511.310.1抑制率(％)45.333.325.722.635.8因此，金莲花抗肿瘤提取物的制备方法为：哈萨克药金莲花经有机溶剂本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种哈萨克药金莲花提取物，其特征为，哈萨克药金莲花经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用体积比100：1‑100:6石油醚：丙酮混合溶剂洗脱，继用体积比100：8‑100:30的石油醚：丙酮混合溶剂洗脱，石油醚：丙酮100：8‑100:30洗脱液即得。
【技术特征摘要】
1.一种哈萨克药金莲花提取物，其特征为，哈萨克药金莲花经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用体积比100：1-100:6石油醚：丙酮混合溶剂洗脱，继用体积比100：8-100:30的石油醚：丙酮混合溶剂洗脱，石油醚：丙酮100：8-100:30洗脱液即得。2.如权利要求1所述的哈萨克药金莲花提取物，其特征为，先用体积比100:6的石油醚-丙酮混合溶剂洗脱，继用体积比100:30的石油醚-丙酮混合溶剂洗脱，石油醚-丙酮100:30洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该提取物。3.如权利要求1或2所述的金莲花提取物，其特征为，提取用有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂或乙醇水混合溶剂，优选甲醇或95%乙醇，提取物提取用有机溶剂用量为药材重量的2-50倍（重量/体积比）。4.如权利要求1-3任何一项所述哈萨克药金莲花提取物，其特征为，石油醚-丙酮混合溶剂洗脱体积...
【专利技术属性】
技术研发人员：王金辉，黄健，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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