本发明专利技术公开了一种全细胞生物催化制备手性(S)‑乙偶姻的方法，包括以下步骤：首先将丁二酮还原酶基因以及甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌中进行共表达，得到重组大肠杆菌；然后以所述重组大肠杆菌休止细胞为全细胞生物催化剂，丁二酮为底物，甲酸或甲酸盐为辅酶NADH再生的氢供体，在水相中不对称还原反应生成(S)‑乙偶姻。本发明专利技术利用细胞本身完整的辅酶再生系统，只需要添加适量的甲酸或甲酸盐作为氢供体，提高菌体的转化能力，不需要添加昂贵的辅酶NADH，(S)‑乙偶姻产量可高达46.1 g/L，工艺简单高效，生产成本低，解决了传统生物转化效率低以及成本高的问题，具有极高的经济价值，适于规模化商业应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化工领域，具体涉及一种全细胞生物催化剂制备手性(S)-乙偶姻的方法。
技术介绍
乙偶姻(acetoin)具有明显的奶酪香、脂香特征，天然地存在于玉米、葡萄、苹果、草莓、黄油、干酪、酒类、可可等各类食品中，国家标准GB2760-86规定其为允许添加食用的食品香料。乙偶姻主要用于奶油、乳品、咖啡、酸奶等香料的生产。此外，乙偶姻是一种重要的化学合成中间体，美国能源部将乙偶姻列为30种优先开发利用的平台化合物之一，可广泛应用于食品、制药、化工等领域。乙偶姻存在(S)-乙偶姻和(R)-乙偶姻两种旋光异构体，天然微生物发酵产生的都是(S)-乙偶姻和(R)-乙偶姻的旋光异构体混合物。手性乙偶姻(即单一构型的旋光异构体)除了具有旋光异构体混合物上述应用之外，还具有特殊的用途，例如用于合成手性药物和液晶复合材料【Lett.Appl.Microbiol.,2013,57:274-281；Bioresource Technol.,2013,137:111-115；Bioresource Technol.,2011,10741-10744；PLoS ONE,2010,5:e8860；Crit.Rev.Microbiol.,2007,33,127-140；Biotechnol.Adv.,2011,29,351-364】。手性乙偶姻的生产方法主要分为两类：化学法与生物法。化学法合成过程繁琐，最后还需要进行工艺复杂的手性拆分，存在成本高、收率低、光学纯度低、高能耗、高污染的问题，且原料来源于不可再生的化石资源——石油，原料来源受到限制。生物法是一种十分具有发展前景的环境友好合成方法，近年来受到了越来越多的关注。然而，常规生物发酵法获得的都是旋光异构体混合物，手性拆分成本较高，而纯酶催化法需要破碎细胞和分离纯化酶，而且需要加入昂贵的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(辅酶NADPH)或者还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶NADH)，成本较高。全细胞生物催化的本质是利用细胞内的酶进行催化，综合了发酵法和酶法催化这两种技术的优点，并克服了发酵法和酶法存在的诸多缺点，具有高立体选择性，不需要添加外源性辅酶、破碎细胞和分离纯化酶，因此近年来更多的被应用于高值化合物合成。2013年，Gao等在大肠杆菌中表达Gluconobacter oxydans的羰基还原酶和Bacillus Subtills的葡萄糖脱氢酶，利用纯化后的羧基还原酶和葡萄糖脱氢酶进行催化反应，当添加辅酶NADPH时，(S)-乙偶姻产量为12.2g/L【Bioresource Technology；2013,(137):111-115】；该研究使用的是纯酶作为催化剂，没有使用全细胞催化系统。2014年，谢能中等公开了利用辅酶再生系统，构建丁二酮还原酶和葡萄糖脱氢酶基因共表达系统生产(S)-乙偶姻的方法，具体是将Paenibacillus polymyxa的丁二酮还原酶基因(dar)和Bacillus subtilis的葡萄糖脱氢酶基因(gdh)在大肠杆菌中共表达，并以此重组大肠杆菌休止细胞为生物催化剂，以丁二酮和葡萄糖为底物，生产手性(S)-乙偶姻【中国专利申请CN104087601A】。该专利技术工艺简单高效，(S)-乙偶姻的光学纯度高，但产量还是偏低，仅28g/L。经过广泛的文献和专利检索，我们发现迄今为止尚未有同时将丁二酮还原酶基因和甲酸脱氢酶基因导入大肠杆菌中进行共表达，并以此重组菌株制备全细胞催化剂实现(S)-乙偶姻合成与辅酶NADH再生相偶联的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，在现有技术的基础上，优化还原酶和脱氢酶的共表达系统的组成，提高辅酶再生能力，在较高的光学纯度下，显著提高(S)-乙偶姻的产量，并保持工艺简单高效的特点，从而使成本大幅降低。本专利技术提出了一种引入甲酸脱氢酶协同丁二酮还原酶共表达生产(S)-乙偶姻的新方法，技术方案具体是：一种全细胞生物催化剂制备手性(S)-乙偶姻的方法，首先将丁二酮还原酶基因和甲酸脱氢酶基因导入大肠杆菌中进行共表达，得到重组大肠杆菌；然后以所述重组大肠杆菌休止细胞为全细胞生物催化剂，丁二酮为底物，甲酸或甲酸盐为辅酶NADH再生的氢供体，在水相中不对称还原反应生成(S)-乙偶姻，实现手性(S)-乙偶姻的高效低成本合成。本专利技术是利用丁二酮还原酶可以催化丁二酮不对称还原生成手性(S)-乙偶姻，以及甲酸脱氢酶能够实现胞内辅酶NADH再生的性质，将丁二酮还原酶基因和甲酸脱氢酶基因导入大肠杆菌中进行共表达，使重组大肠杆菌的休止细胞具有同步还原丁二酮和再生辅酶NADH的能力，并将其作为全细胞催化剂实现手性(S)-乙偶姻的高效低成本生产。其中，所述丁二酮还原酶基因可来源于肠杆菌属(Enterobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)和沙雷菌属(Serratia)；所述甲酸脱氢酶基因可来源于酵母属(Saccharomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、毕赤酵母属(Pichia)和假丝酵母属(Candida)。进一步的，所述丁二酮还原酶基因来源菌株优选Enterobacter cloacae、Rhodococcus erythropolis或Klebsiella pneumoniae；甲酸脱氢酶基因来源菌株优选Saccharomyces cerevisiae。进一步，所述甲酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述丁二酮还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。上述的重组大肠杆菌是采用常规(参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》)的方法将丁二酮还原酶基因和甲酸脱氢酶基因同时插入表达质粒并转化到大肠杆菌(优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3))中，然后经筛选获得。所述用于构建含丁二酮还原酶基因的大肠杆菌表达载体的出发载体可以是pET-22b、pET-28a、pET-32、pETDuet-1或pTrc99a。重组大肠杆菌含有异源的丁二酮还原酶和甲酸脱氢酶基因，为革兰氏阴性菌，需氧或兼性厌氧生长，较佳培养温度为37℃，其休止细胞可用于催化丁二酮生产手性(S)-乙偶姻。更具体的，本专利技术所述全细胞生物催化制备手性(S)-乙偶姻的方法，包含以下步骤：(1)重组大肠杆菌：将丁二酮还原酶基因和甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌中进行共表达，得到重组大肠杆菌；(2)平板培养：将步骤(1)所得的重组大肠杆菌划线到含有琼脂和筛选抗生素的LB平板培养基上，37℃过夜培养；(3)种子培养：在超净台用牙签挑取步骤(2)平板上的一个单菌落，然后接种到含有筛选抗生素的LB液体培养基中，37℃培养6～12h；(4)诱导培养：在无菌条件下，取步骤(3)所得的种子培养液接种到含有筛选抗生素的LB液体培养基中，25～40℃培养1～5h，然后再加入终浓度为0.1～2mM的IPTG，16～30℃诱导10～20h，得到诱导培养物；(5)收集菌体：将步骤(4)所得的诱导培养物于转速为5,000～8,000rpm的条件下离心5～15min，分离得到菌体沉淀；本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种全细胞生物催化制备手性(S)‑乙偶姻的方法，其特征在于，将丁二酮还原酶基因和甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌中进行共表达，得到重组大肠杆菌；以所述重组大肠杆菌休止细胞为全细胞生物催化剂，丁二酮为底物，甲酸或甲酸盐为辅酶NADH再生的氢供体，在水相中不对称还原反应生成(S)‑乙偶姻。
【技术特征摘要】
2015.07.13 CN 20151040665721.一种全细胞生物催化制备手性(S)-乙偶姻的方法，其特征在于，将丁二酮还原酶基因和甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌中进行共表达，得到重组大肠杆菌；以所述重组大肠杆菌休止细胞为全细胞生物催化剂，丁二酮为底物，甲酸或甲酸盐为辅酶NADH再生的氢供体，在水相中不对称还原反应生成(S)-乙偶姻。2.如权利要求1所述的全细胞生物催化制备手性(S)-乙偶姻的方法，其特征在于，所述丁二酮还原酶基因来源菌株选自Enterobacter cloacae、Rhodococcus erythropolis或Klebsiella pneumoniae；所述甲酸脱氢酶基因来源菌株是Saccharomyces cerevisiae。3.如权利要求1或2所述的全细胞生物催化制备手性(S)-乙偶姻的方法，其特征在于，所述甲酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述丁二酮还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。4.如权利要求3所述的全细胞生物催化制备手性(S)-乙偶姻的方法，其特征在于，所述用于构建含丁二酮还原酶基因的大肠杆菌表达载体的出发载体选自pET-22b、pET-28a、pET-32、pETDuet-1或pTrc99a。5.如权利要求1、2、4任一所述的全细胞生物催化制备手性(S)-乙偶姻的方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：（1）重组大肠杆菌：将丁二酮还原酶基因和甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌中进行共表达，得到重组大肠杆菌；（2）平板培养：将步骤（1）所得的重组大肠杆菌划线到含有琼脂和筛选抗生素的LB平板培养基上，37°C过夜培养；（3）种子培养：在超净台用牙签挑取步骤（...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢能中，李检秀，黄日波，黄艳燕，杜奇石，严少敏，陈先锐，刘祺霞，
申请(专利权)人：广西科学院，
类型：发明
国别省市：广西;45
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