一种牛肝菌中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法，其特征在于：采用正己烷/氢氧化钠水溶液体系将牛肝菌中的烟碱提取出来后，再经过阳离子交换固相萃取对萃取液进行净化，并采用配有毛细管色谱柱的气相色谱仪将烟碱和萃取液中的其他杂质分开，利用气相色谱—同位素质谱仪GC‑IRMS分析牛肝菌中烟碱的碳稳定同位素比值δ13C，氢稳定同位素比值δD和氮稳定同位素比值δ15N，再根据烟碱同位素标准物质中的δ12C、δD和δ15N测定值，校准计算牛肝菌中烟碱的δ12C、δD和δ15N值。本发明专利技术利用GC‑IRMS技术，实现了牛肝菌中烟碱的碳、氢、氮稳定同位素比值的准确测定，为相关产品中烟碱的溯源提供了技术支持和科学依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于稳定同位素分析
，具体涉及一种牛肝菌中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法。
技术介绍
当前，判定市售烟草提取物及不同纯度烟碱中烟碱的来源，具有重要的意义。除烟草外，牛肝菌等作物也含有烟碱，虽然牛肝菌的烟碱含量相对很低，但与其他茄科类植物相比，其烟碱含量相对较高，所以，牛肝菌是自然界中烟碱的重要来源之一。当前，许多市售戒烟产品、电子烟、保健产品等都含有烟碱，但是，对于其中烟碱的来源，尚无统一定论。所以，烟碱溯源技术的开发，具有重要的理论及现实意义。在产品品种、产地等溯源的方法中，稳定同位素技术是一项相对高效的分析手段。由于生物体内的同位素组成受气候，环境和生物代谢类型等因素的影响，不同种类及不同地域来源的食品原料中同位素自然丰度存在差异，利用这种差异可以对不同种类及来源的产品进行溯源（林光辉, 稳定同位素生态学. 高等教育出版社,2013）。但是，目前尚未见牛肝菌中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的正是基于上述技术空白，建立了一种牛肝菌中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法。本方法通过液液萃取、固相萃取等过程对牛肝菌中的烟碱进行提取、浓缩和净化，且一次样品前处理过程即可同时测定牛肝菌中烟碱的碳、氢、氮稳定同位素比值。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种牛肝菌中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法，采用正己烷/氢氧化钠水溶液体系将牛肝菌中的烟碱提取出来后，再经过阳离子交换固相萃取对萃取液进行净化，并采用配有毛细管色谱柱的气相色谱仪将烟碱和萃取液中的其他杂质分开，利用气相色谱—同位素质谱仪GC-IRMS分析牛肝菌中烟碱的碳稳定同位素比值δ13C，氢稳定同位素比值δD和氮稳定同位素比值δ15N，再根据烟碱同位素标准物质中的δ12C、δD和δ15N测定值，校准计算牛肝菌中烟碱的δ12C、δD和δ15N值。其具体步骤如下：（1）牛肝菌中的烟碱的提取、浓缩与净化：采用正己烷/氢氧化钠水溶液体系将牛肝菌中的烟碱提取出来后，再经过阳离子交换固相萃取对烟碱进行净化；（2）采用带有毛细管气相色谱柱的气相色谱仪将烟碱与萃取液中的其他杂质分开；（3）用在线燃烧装置将烟碱中的C转化成CO2，将烟碱中的N转化成N2，用同位素质谱仪（IRMS）测定烟碱产生CO2中的δ13C和N2中的δ15N值；（4）将在线燃烧装置切换为热转化模式，用同位素质谱仪（IRMS）测定烟碱产生H2中的δD值（即δ2H）。（5）通过标准物质已标定的δ13C，δD和δ15N值，得到牛肝菌中烟碱的δ13C，δD和δ15N值。步骤（1）中的提取与净化过程如下：提取：称取约5 g牛肝菌样品，置于50 mL离心管中，分别加入30 mL 1%氢氧化钠水溶液和5 mL正己烷，2000 rpm下涡旋10 min后，在10000 rpm下离心2 min，将上层有机相转移至另一个50 mL离心管中，再以5 mL正己烷萃取两次，合并有机相；浓缩、净化：用甲酸将有机相的pH值调至3-4，然后在40℃下将其氮吹浓缩近干，加入3 mL 2%甲酸水溶液溶解残渣后，使用阳离子交换固相萃取小柱（60 mg，Waters Oasis MCX）进行净化处理，其步骤为：萃取柱使用前分别用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL 2%甲酸水溶液活化，之后将待净化溶液转移至柱中，依次用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，然后用10 mL 5%氨化甲醇洗脱，收集洗脱液；洗脱液用甲酸调pH值至3-4，40℃下氮吹浓缩近干，残渣用5%氢氧化钠水溶液调pH值至碱性，加入1.5 mL二氯甲烷，在2000 rpm下涡旋2 min后，以10000 rpm离心1 min，再取有机相进行GC-IRMS分析。所述方法的仪器分析条件为：（1）气相色谱条件：色谱柱：中等极性毛细管色谱柱(30 m × 0.32 mm × 0.25 μm)；检测器温度：250 ℃；进样口温度：250 ℃；载气：氮气（纯度≥99.999%），恒流流速：2.0 mL/min；进样量：1 μL，不分流进样；升温程序：初始温度80 ℃，保持1 min，以15 ℃/min的速率至260 ℃，保持6 min.（2）燃烧转化装置条件：测定δ13C或δ15N：使用氧化燃烧管，设置温度为1000℃。管内填装镍/氧化镍 (Ni/NiO)，氧化镍作弱氧化剂，将样品中的C氧化成CO2，将样品中N氧化成NxOy，同时，氧化镍转化为镍单质，充入O2可再生氧化镍，另外，镍单质可作特殊还原剂，将NxOy转化为N2，样品最终反应生成CO2和N2。氧化燃烧管使用前应注入O2 一个小时用于氧化管的再生。测定δ15N，需使用液氮冷阱冻结除去CO2高凝固点气体，防止CO2进入离子源打出碎片离子[CO+ ] m/z 28, 29对[N2+ ]m/z 28, 29造成干扰。测定δD：使用高温裂解管，设置温度为1450℃。高温裂解管使用前应注入CH4一个小时用于反应管涂炭。（3）质谱条件为：离子源真空为1.8x 10-6 mBar, 电压3.04 kV，电流1.50 mA。本方法通过液液萃取、阳离子交换固相萃取等步骤对牛肝菌中的烟碱进行提取、浓缩和净化，且一次样品前处理过程即可同时测定牛肝菌中烟碱的碳、氢、氮稳定同位素比值，具有效率高、重复性好的优点，为烟草提取物中烟碱的溯源提供了技术支持和科学依据。附图说明图1为GC-IRMS测定标准溶液烟碱中δ13C的离子流图谱，其中上图纵坐标是比率（Ratio），下图纵坐标是强度（Intensity [mV]）;图2为GC-IRMS测定标准溶液烟碱中δ15N的离子流图谱，其中上图纵坐标是比率（Ratio），下图纵坐标是强度（Intensity [mV]）;图3为GC-IRMS测定标准溶液烟碱中δD的离子流图谱，其中上图纵坐标是比率（Ratio），下图纵坐标是强度（Intensity [mV]）。具体实施方式本专利技术通过以下具体实施例作进一步描述，但不限制本专利技术。实施例1：1、仪器及试剂同位素质谱仪（AS1310自动进样器，Trace GC Ultra气相色谱仪，GC IsoLink燃烧与热转化装置（燃烧装置用来测定烟碱中的碳和氮，热转化装置用来测定烟碱中的氢），Delta V Advantage稳定同位素比质谱仪。美国Thermo Fisher公司）；AE163电子天平（感量：0.0001 g，瑞士Mettler公司）；全自动氮吹仪（型号：JTZD-DCY12S，杭州聚同电子有限公司）；高速粉碎机（武汉银彩科技有限公司）；漩涡振荡器（美国Coleparmer Votex-Genie）；高速台式冷冻型离心机（德国SIGMA 3-30K）；高纯氦气（99.999%，载气）；烟碱标准物质来自于美国印第安纳大学同位素实验室，#2（δ13C =7.72±0.02‰，δ15N=-5.94±0.15‰），#3（δ13C =-30.05±0.02‰，δ15N=-33.62±0.18‰），#4（δ13C =-2.06±0.02‰，δ15N=-15.49±0.13‰），#5（δ13C =-29.63±0.01‰，δ15N=--6.03±0.04‰，δD=-161.30±1.7‰）；正己烷（色谱本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种牛肝菌中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法，其特征在于：采用正己烷/氢氧化钠水溶液体系将牛肝菌中的烟碱提取出来后，再经过阳离子交换固相萃取对萃取液进行净化，并采用配有毛细管色谱柱的气相色谱仪将烟碱与萃取液中的其他杂质分开，利用气相色谱—同位素质谱仪GC‑IRMS分析牛肝菌中烟碱的碳稳定同位素比值δ13C，氢稳定同位素比值δD和氮稳定同位素比值δ15N，再根据烟碱同位素标准物质中的δ12C、δD和δ15N测定值，校准计算牛肝菌中烟碱的δ12C、δD和δ15N值。
【技术特征摘要】
1.一种牛肝菌中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法，其特征在于：采用正己烷/氢氧化钠水溶液体系将牛肝菌中的烟碱提取出来后，再经过阳离子交换固相萃取对萃取液进行净化，并采用配有毛细管色谱柱的气相色谱仪将烟碱与萃取液中的其他杂质分开，利用气相色谱—同位素质谱仪GC-IRMS分析牛肝菌中烟碱的碳稳定同位素比值δ13C，氢稳定同位素比值δD和氮稳定同位素比值δ15N，再根据烟碱同位素标准物质中的δ12C、δD和δ15N测定值，校准计算牛肝菌中烟碱的δ12C、δD和δ15N值。2.根据权利要求1所述的牛肝菌中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法，其特征在于：该方法的具体步骤如下：(1)牛肝菌中的烟碱的提取、浓缩与净化：采用正己烷/氢氧化钠水溶液体系将牛肝菌中的烟碱提取出来后，再经过阳离子交换固相萃取对烟碱进行净化；(2)采用带有毛细管气相色谱柱的气相色谱仪将烟碱与萃取液中的其他杂质分开；(3)用在线燃烧装置将烟碱中的C转化成CO2，将烟碱中的N转化成N2，用同位素质谱仪（IRMS）测定烟碱产生CO2中的δ13C和N2中的δ15N值；(4)将在线燃烧装置切换为热转化模式，用同位素质谱仪IRMS测定烟碱产生H2中的δD值；(5)通过标准物质已标定的δ13C，δD和δ15N值，得到牛肝菌中烟碱的δ13C，δD和δ15N值。3.根据权利要求1所述的牛肝菌中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法，其特征在于：步骤（1）中的提取与净化过程如下：提取：称取5 g牛肝菌样品，置于50 mL离心管中，分别加入30 mL 1%氢氧化钠水溶液和5 mL正己烷，2000 rpm下涡旋10 min后，在10000 rpm下离心2 min，将上层有机相转移至另一个50 mL离心管中，再以5 mL正己烷萃取两次，合并有机相；浓缩、净化：用甲酸将有机相的pH值调至3-4，然后在40℃下将其氮吹浓缩近干，加入3 mL 2%甲酸水溶液溶解残渣后，使用阳离子交换固相萃...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩书磊，陈欢，马潇，付亚宁，刘彤，侯宏卫，胡清源，
申请(专利权)人：国家烟草质量监督检验中心，
类型：发明
国别省市：河南;41
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