本发明专利技术公开了一种铜绿假单胞菌ZJPH1504及其制备西他列汀手性中间体的应用，本发明专利技术铜绿假单胞菌ZJPH1504可用于高立体选择性不对称还原潜手性酮化合物(Ⅱ)制备西他列汀手性中间体式(Ⅰ‑a)化合物，产物光学纯度高，e.e.值>99.9％。在pH 7.5的磷酸缓冲液体系中，加入9g/L的底物，反应30h，S‑型还原产物的产率为60.2％。当反应体系中添加有机溶剂时可有效改善催化效率，提高反应产率，并缩短反应时间，尤其是反应体系中添加邻苯二甲酸二丁酯，可使反应产率提高至75.6％，反应时间缩短至24h，e.e.值大于99.9％。
【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一种西他列汀手性中间体的制备，特别涉及一种利用新菌株--铜绿假单胞菌ZJPH1504生物催化不对称合成西他列汀手性中间体的方法。(二)
技术介绍
3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮(Ⅰ)(其分子量：408.102)是制备式(Ⅲ)化合物(西他列汀，Sitagliptin，商品名)的关键中间体，其中化合物(Ⅰ)S构型，即式(Ⅰ-a)为本专利技术述及的制备西他列汀关键手性中间体。式(Ⅲ)的化学名称为(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。式(Ⅰ-a)为式(Ⅰ)的(S)-异构体，式(Ⅰ-b)为式(Ⅰ)的(R)-异构体西他列汀是由Merck Sharp&Dohme Ltd.公司开发，于2006年10月17日经美国FDA批准上市的首个二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂，可用于治疗II型糖尿病。式(Ⅲ)是在专利WO 03004498中公开的其具体药物成分。WO 2010032264公开了式(Ⅰ)化合物，以及化学还原制备路线1：在(非)酸性条件下，于合适的溶剂中，利用合适的含硼烷还原剂，由式(Ⅱ)化合物4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮或其金属盐还原，获得式(Ⅰ)消旋体化合物3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。制备路线1：该路线中由于金属催化剂的使用造成反应终产物中有痕量金属物残留，同时生产过程中使用大量有机溶剂，获得的产物为消旋体，为非选择性催化化学合成。WO 2012/046254 A2中公开了通过构建共表达氧化还原酶和葡萄糖脱氢酶的工程菌，用于催化式(Ⅱ)不对称还原制备(Ⅰ-a)的制备路线2，反应时间为25～30h，产率为72％，e.e.值>99％。该路线的转化效率仍较低，且反应体系中生物催化剂加量大，单位菌体转化产物的生产能力偏低。WO 2015/071861 A2中公开了利用青霉菌Penicillium brevicompactum MTCC 5962生物转化制备光学活性式(Ⅰ-a)的工艺方案，反应48h，转化率为99％，e.e.值>99％。该路线将反应过程与菌体发酵过程同时进行，增加了后期产物的分离难度。制备路线2：(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一株产羰基还原酶的微生物新菌株-铜绿假单胞菌ZJPH1504，利用全细胞催化4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮不对称还原制备得到(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。与化学还原路线相比，该方法的立体选择性高，催化剂制备成本低，且转化过程环境友好。并通过构建一种有机介质反应体系以有效解决底物难溶性和产率偏低等问题。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一株新菌株—铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ZJPH1504，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2016188，保藏日期为：2016年4月11日，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。本专利技术所述铜绿假单胞菌ZJPH1504分离自浙江工业大学(浙江杭州)校园内采集的土
样，经以下分离筛选流程如下：土样采集→富集培养→平板初筛→菌株纯化→液体培养→活性复筛→TLC/HPLC检测产物→获得目的菌株。本专利技术还提供一种所述铜绿假单胞菌ZJPH1504在制备西他列汀手性中间体中的应用，具体所述的应用以铜绿假单胞菌ZJPH1504经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮为底物，至少以pH 6～9的缓冲液(优选pH 7～8)为反应介质构成反应体系，在25～50℃(优选40～45℃)、150～250rpm(优选200rpm)条件下进行反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。进一步，所述底物用量以缓冲液体积计为2～21g/L(优选4～9g/L)，湿菌体用量以缓冲液体积计为50～350g/L(优选100～150g/L)。进一步，所述酶源按如下方法制备：(1)斜面培养：将铜绿假单胞菌ZJPH1504接种至斜面培养基，25～30℃培养36h，获得斜面菌种；斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏6g/L，(NH4)2SO4 3g/L，KH2PO4 1.5g/L，NaCl 0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，琼脂粉15～20g/L，溶剂为水，pH 6.5；(2)种子培养：将斜面菌种接种至种子培养基中，25～30℃、150～250rpm培养12～24h，获得种子液；种子培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏6g/L，(NH4)2SO4 3g/L，KH2PO4 1.5g/L，NaCl 0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，溶剂为水，pH 6.5；(3)发酵培养：将种子液以体积浓度为4～10％(优选8％)的接种量接种至发酵培养基中，装液量为90mL/250mL摇瓶，25～30℃、150～250rpm培养24～28h，优选30℃、200rpm培养28h发酵结束后，将发酵液离心，所得沉淀用0.1M、pH 8.0缓冲液洗涤，收集湿菌体，即为酶源；发酵培养基终浓度组成为：麦芽糖30.45g/L，蛋白胨17.31g/L，NaCl 0.98g/L，溶剂为水，pH 7.5。进一步，所述缓冲液选用范围包括磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液，并在0.01M和0.2M的离子强度范围内选用。所用磷酸盐缓冲液离子强度范围为0.01～0.2M，优选0.1M。进一步，为促进辅酶再生，提高反应效率，所述反应体系中还需添加辅助底物，所述辅助底物为下列之一：葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，甲醇、乙醇、异丙醇、甘油，L-丙氨酸、L-谷氨酸和L-半胱氨酸，所述辅助底物添加量以缓冲液体积计为4～100g/L。优选地，所述反应以葡萄糖、蔗糖和甘油中的一种为辅助底物，最优选甘油(优选40～80g/L，最优选60g/L)。相同条件下反应24h，不添加辅助底物的生物催化产率为14.7％(水相转化，具体参见实施
例12)，添加60g/L甘油作辅助底物的生物催化产率可提高至55.7％(本文档来自技高网...
【技术保护点】
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ZJPH1504，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2016188，保藏日期为：2016年4月11日，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。
【技术特征摘要】
1.铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ZJPH1504，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2016188，保藏日期为：2016年4月11日，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。2.一种权利要求1所述铜绿假单胞菌ZJPH1504在制备西他列汀手性中间体中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用以铜绿假单胞菌ZJPH1504经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮为底物，至少以pH 6～9的缓冲液为反应介质构成反应体系，在25～50℃、150～250rpm条件下进行转化，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物用量以缓冲液体积计为2～21g/L，湿菌体用量以缓冲液体积计为50～350g/L。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应体系中还添加有辅助底物，所述辅助底物为下列之一：葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，甲醇、乙醇、异丙醇、甘油，L-丙氨酸、L-谷氨酸和L-半胱氨酸，所述辅助底物添加量以缓冲液体积计为4～100g/L。6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述酶源按如下方法制备：(1)斜面培养：将铜绿假单胞菌ZJPH1504接种至斜面培养基，25～30℃培养36h，获得斜面菌种；斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏6g/L，(NH4)2SO4 3g/L，KH2PO4 1.5g/L，NaCl 0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.75g...
【专利技术属性】
技术研发人员：王普，孙佳，黄金，沈琦，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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