一种桑叶金属硫蛋白的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种桑叶金属硫蛋白的制备方法，它由桑叶蛋白提取、构建蛋白融合载体表达、生物膜分离、定向金属离子缓释、酶切洗脱、纯化精制冻干燥六个步骤完成其制备方法；该桑叶金属硫蛋白的蛋白来源是纯植物中提取分离获得，植物蛋白资源得到充分利用，与其它来源的MT原料相比，具有原料来源可靠、提取过程简单、成本低、绿色安全等特点；浓缩液体蛋白与金属离子诱导，选择的是人体必须的金属元素作为融合载体表达体，能够可溶性地、高产率稳定表达目标产物；目的蛋白能与金属离子定量缓释有效进行分类表达，得到纯化后的不同结构的MT蛋白分子；提取过程的周期短，处理量大，反应所得目标产物回收率高，损失小、纯度高、无二次污染等特点。

【技术实现步骤摘要】
201610358800

【技术保护点】
一种桑叶金属硫蛋白的制备方法，其特征是它由桑叶蛋白提取（1）、构建蛋白融合载体表达（2）、生物膜分离（3）、定向金属离子缓释（4）、酶切洗脱（5）、纯化精制冻干燥（6）六个步骤完成其制备方法；桑叶蛋白提取（1）：经桑叶原料预处理得到桑叶浆液采用Tirs－HCl缓冲液进行匀浆，将桑叶浆液均匀加热至90℃静置冷却至65℃，再配制加入一定比例的2‑羟基丙酸与乙醇混合液，进行桑叶蛋白加热沉淀，静置45分钟后观察，所得沉淀部分为桑叶粗蛋白；构建蛋白融合载体表达（2）：经上述桑叶蛋白提取（1）步骤得到的桑叶粗蛋白设定目标产物模型装置，将桑叶粗蛋白利用分子筛水热转化法原理，通过吸附，除去大分子有机物，分级沉淀小分子蛋白得到目标产物MT蛋白溶液混合体；生物膜分离（3）：经上述构建蛋白融合载体表达（2）步骤得到的MT蛋白溶液混合体，经生物膜固液分离，其过程包括浓缩、去杂、杀菌、脱色一次性处理完成，保留蛋白分子为3KDa～7KDa目标产物为所得MT蛋白浓缩液体；定向金属离子缓释（4）：经上述生物膜分离（3）步骤后的富集浓缩液体MT蛋白，采用25℃、PH=7条件下、0.2mol/l磷酸钠缓冲液、配制还原剂二硫苏糖醇( DTT，1mmol/L)或B2巯基乙醇( 10mmol/L)作为巯基(－SH)结构活性稳定剂，分类定向缓释金属离子与浓缩液体蛋白结合诱导合成三种不同结构类型的巯基蛋白(MTs‑PS¯)等电点(pI)为4；在中性pH条件下，MT带负电荷，蛋白肽链通过Cys残基的，SH以硫酯键的形式配位结合金属离子；静置30分钟后，形成新的融合蛋白，总巯基采用DTNB巯基法测得巯基含量，金属离子采用原子吸收光谱测定，所得产物为：MTs‑PS¯‑Ⅰ、MTs‑PS¯‑Ⅱ、MTs‑PS¯‑Ⅲ三类巯基化合物，待进行下一步处理；酶切洗脱（5）：经上述定向金属离子缓释（4）步骤后分别得到的富集MTs‑PS¯‑Ⅰ、MTs‑PS¯‑Ⅱ、MTs‑PS¯‑Ⅲ加入GST酶切液和巯基乙醇的混合液，柱外酶切，酶切后的反应混合液经膜过滤装置浓缩后，收集洗脱峰；分别配制硅酸盐和氯化钠的混合溶液，进行重复洗脱至中性条件下形成多聚体蛋白，即为MT‑Ⅰ、MT‑Ⅱ、MT‑Ⅲ的蛋白浓缩液体；纯化精制冻干燥（6）：将酶切洗脱（5）步骤得到的富集MT‑Ⅰ、MT‑Ⅱ、MT‑Ⅲ的蛋白浓缩液，分别收集洗脱峰的洗脱液，经Sephadex G‑25层析柱两次脱盐，收集洗脱峰的洗脱液进行真空冻干，得到纯度95%以上金属硫蛋白精品，感官呈雪白色冻干粉末即为高纯度品质的MT冻干粉；贮存条件为‑14℃～25℃最佳。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：左有权，
申请(专利权)人：湖南海熙生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43