一种简便兔肝金属硫蛋白的制备方法技术

本发明专利技术涉及金属硫蛋白的分离技术领域，具体涉及一种简便兔肝金属硫蛋白的制备方法。本发明专利技术的目的是要克服现有技术中存在的工序复杂、成本高的问题。本发明专利技术提供的一种简便的兔肝金属硫蛋白的制备方法，依次包括下述步骤：①诱导；②金属硫蛋白的提取；③纯化及脱盐：离心上清液经超滤后，直接进行阴离子交换层析分离、洗脱，用巯基试剂对流出液进行点滴检测，当巯基试剂显色时，立即连接SephadexG-50或SephadexG-25柱进行脱盐；④脱盐后的洗脱液进行冷冻干燥，得金属硫蛋白产品。本工艺用控制提取液的pH，直接进行层析分离，并将分离柱和脱盐柱串联使用，简化了工艺流程，操作简单易行，适合于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及金属硫蛋白的分离
，具体涉及ー种简便兔肝金属硫蛋白的制备方法。
技术介绍
金属硫蛋白(metallothionein,简称MT)是ー类广泛存在于生物体的与金属结合的低分子蛋白质。研究证明，金属硫蛋白直接參与机体微量元素的储存、运输和代谢，具有许多特殊的生物学特性和功能，如解除重金属毒性，清除自由基，抗辐射，抗衰老等，已经被广泛用于医药，食品、保健品和化妆品等行业中。 目前，兔肝金属硫蛋白的生产通常包括缓冲液提取、有机溶剂沉淀除杂、低温离心、热变性除杂、こ醇沉淀MT、缓冲液溶解金属硫蛋白和层析纯化等エ艺步骤(參考专利92111198. 3,200440013212. x,20090062168. 4)。上述的エ艺中，金属硫蛋白经溶剂提取后，需要在高浓度こ醇(一般こ醇浓度大于75%)，温度在_20°C过夜，使金属硫蛋白充分沉淀析出，再用溶剂溶解纯化等，这些步骤存在以下缺陷，(I)使用了大量的こ醇，増加了成本，(2)即使使用大于75%的こ醇,也很难使金属硫蛋白完全析出，造成金属硫蛋白的浪费；(3)过夜沉淀金属硫蛋白，延长了金属硫蛋白的生产周期。因此，选择简单的，快速的，合理的生产エ艺是很有必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的是要提供一种简便的兔肝金属硫蛋白的制备方法，以克服现有技术中存在的エ序复杂、成本高的问题。本专利技术的目的是这样实现的，ー种简便兔肝金属硫蛋白的制备方法，依次包括下述步骤 ①诱导采取每日腹腔皮下注射的方法给成体肉兔注射硫酸锌，注射次数为7次，注射剂量范围为10mg/kg-250mg/kg硫酸锌,剂量呈依次递增形式，于第七次给药24h后处死动物，取出肝脏，保存于-20°C，备用； ②金属硫蛋白的提取新鲜兔肝脏，生理盐水清理血迹后称重，加入2-4倍量冰箱预冷的缓冲液研磨，迅速将研磨液加热至78 82°C，保持5-10min，然后快速冷却至O 4°C，静置10-30分钟，冷冻离心分离出上清液，调PH值至4. 5 4. 8，在0_5°C下放置20-40分钟再次分离出上清液，调PH至6. 20-6. 40 ； ③纯化及脱盐 将上述的离心上清液经超滤后，直接用琼脂基的DEAE系列树脂进行阴离子交换层析分离，用O. 01M-0. 50M洗脱液洗脱，用巯基试剂对流出液进行点滴检测，当巯基试剂显色时,立即连接Sephadex G-50或Sephadex G-25柱进行脱盐； ④脱盐后的洗脱液进行冷冻干燥，得金属硫蛋白产品。上述步骤③所述超滤选用O. 22 μ的超滤膜。上述步骤③所述的树脂是DEAESepharose Fast Flow或DEAE Sepharose CL-6B。本专利技术具有以下优点I、本技术选用提取液直接经离子交换分离，脱盐，真空冷冻干燥制成成品，減少了高浓度こ醇沉淀金属硫蛋白，再溶解的步骤，降低了生产成本，简化了生产エ艺，缩短了金属硫蛋白的生产周期。2、调节离子凝胶层析上样溶液的pH在6. 20-6. 40，有利于金属硫蛋白的纯化。肉兔肝脏金属硫蛋白分子量约有6500 Da，等电点在3. 9-4. 6，当提取液pH在6. 2-6. 4之间吋，金属硫蛋白仍然保持负电荷，而当等电点在中性和偏碱性蛋白质不带负电荷，或者不带电荷，不会被离子交换剂吸附，从而达到分离纯化的目的。3、纯化和脱盐两个操作步骤中，采用了分离柱和脱盐柱直接串联洗脱的方法，缩短了エ艺时间，減少了金属硫蛋白因操作过程中停留时间过长产生聚合而引起的破坏。具体实施例方式 下面通过具体实施例对本专利技术进行详细说明。实施例I : (I)诱导 取伊拉肉兔一只，采取每日腹部皮下注射硫酸锌水溶液，注射次数为7次，分别为10mg/kg>20mg/kg>50mg/kg> 100mg/kg、150mg/kg>200mg/kg>250mg/kg,第七次给药 24 小时后宰杀兔子，取肝脏保存于-20°C，待用。(2)金属硫蛋白的水溶液提取 新鲜兔肝脏，用生理盐水清理血迹后称重，加入2. 8倍量经冰箱预冷的PH8. 6的O. 02MTris-HCl缓冲液,研磨,将研磨液置水浴锅中，迅速加热至80°C,保持8分钟后，于冰水浴快速冷却至O 4°C,静置30min,然后冷冻离心分离,上清液用稀盐酸调pH值4. 5,冰水浴中保持30分钟后冷冻离心分离，上清液再用IN氢氧化钠回调pH至6. 4。(3)离子层析分析分离及脱盐 将上述的离心上清液用O. 22 μ的超滤膜过滤，除去溶液中大分子蛋白质后，用DEAESepharose Fast Flow进行离子交换层析,用O. OIM-0. 2M,pH8. 2的Tris-HC梯度洗脱,用巯基试剂点滴试验检测流出情况，当巯基试剂显色时，立即连接Sephadex G-50柱进行脱盐，收集金属硫蛋白含量高的部分。(4)脱盐后的洗脱液进行冷冻干燥，得金属硫蛋白产品。实施例2: (1)诱导同上 (2)金属硫蛋白的提取 新鲜兔肝脏，用生理盐水清理血迹后称重，准确称取兔肝50g，加入经冰箱预冷的PH8. 6的O. OlM Tris-HCl缓冲液150ml，研磨，将研磨液置水浴锅中，迅速加热至82°C，保持5分钟后，于冰水浴快速冷却至O 4°C,静置20min，然后冷冻离心分离，上清液用稀盐酸调PH值在4. 7，冰水浴中保持时间20分钟后冷冻离心分离，上清液IN氢氧化钠回调pH至 6. 3。(3)离子层析分析分离及脱盐 将上述的离心上清液用O. 22 μ的超滤膜过滤，除去溶液中大分子蛋白质后，用DEAESepharose Fast Flow进行离子交换层析,用O. 01_0. 5MNaCl梯度洗脱,用巯基试剂点滴试验检测流出情况，当巯基试剂显色时，立即连接Sephadex G_25柱进行脱盐。(4)同上 实施例3 (1)诱导同上 (2)金属硫蛋白的提取 新鮮兔肝脏，用生理盐水清理血迹后称重，准确称取兔肝100g，加入冰箱预冷的O. OlMTris-HCl,PH8. 2缓冲液280ml，研磨，将研磨液置水浴锅中，迅速加热至78°C，保持10分钟后，于冰水浴快速冷却至O 4°C，静置20min，然后冷冻离心分离，上清液用稀盐酸调pH值 在4. 6，冰水浴中保持时间35分钟后冷冻离心分离，上清液用2N氢氧化钠回调pH至6. 2。(3)离子层析分析分离及脱盐 将上述的离心上清液用O. 22 μ的超滤膜过滤，除去溶液中大分子蛋白质后，用DEAESepharose CL-6B进行离子交换层析，用O. OIM-0. 3Μ的NH4HCO3梯度洗脱，用巯基试剂点滴试验检测流出情况，当巯基试剂显色时，立即连接Sephadex G-50柱进行脱盐。(4)脱盐后的洗脱液进行冷冻干燥，得金属硫蛋白产品。权利要求1.ー种简便兔肝金属硫蛋白的制备方法，依次包括下述步骤 ①诱导采取每日腹腔皮下注射的方法给成体肉兔注射硫酸锌，注射次数为7次，注射剂量范围为10mg/kg-250mg/kg硫酸锌,剂量呈依次递增形式，于第七次给药24h后处死动物，取出肝脏，保存于-20°C，备用； ②金属硫蛋白的提取新鮮兔肝脏，生理盐水清理血迹后称重，加入2-4倍量冰箱预冷的缓冲液研磨，迅速将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种简便兔肝金属硫蛋白的制备方法，依次包括下述步骤：①诱导：采取每日腹腔皮下注射的方法给成体肉兔注射硫酸锌，注射次数为7次，注射剂量范围为10mg/kg？250mg/kg硫酸锌，剂量呈依次递增形式，于第七次给药24h后处死动物，取出肝脏，保存于？20℃，备用；②金属硫蛋白的提取：新鲜兔肝脏，生理盐水清理血迹后称重，加入2？4倍量冰箱预冷的缓冲液研磨，迅速将研磨液加热至78～82℃，保持5？10min，然后快速冷却至0～4℃，静置10？30分钟，冷冻离心分离出上清液，调PH值至4.5～4.8，在0？5℃下放置20？40分钟再次分离出上清液，调pH至6.20？6.40；③纯化及脱盐：将上述的离心上清液经超滤后，直接用琼脂基的DEAE系列树脂进行阴离子交换层析分离，用0.01M？0.30M洗脱液洗脱，用巯基试剂对流出液进行点滴检测，当巯基试剂显色时，立即连接Sephadex？G？50或Sephadex？G？25柱进行脱盐；脱盐后的洗脱液进行冷冻干燥，得金属硫蛋白产品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：党蕊叶，权清转，权启俊，蒋志武，赵淑琳，
申请(专利权)人：陕西省动物研究所，陕西同腾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：