本发明专利技术涉及一种基于改良磁珠法快速提取全血中基因组DNA的方法。该方法包括以下步骤：红细胞裂解、白细胞裂解及DNA吸附、DNA纯化和DNA洗脱。利用DNA定量仪测定DNA浓度与纯度，利用测序仪对PCR扩增产物进行测序，相关的分析软件进行HLA分型结果分析。本发明专利技术具有DNA浓度均一性强、纯度高、HLA分型结果成功率大幅度提高和信噪比合格率高的特点。因此，可广泛地应用于全血样本中基因组DNA的提取中。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于改良磁珠法快速提取全血中基因组DNA的方法。
技术介绍
DNA的提取方法很多，传统的酚氯法、盐析法、过柱法都只能是手工提取，无法自动化，磁珠法利用包裹磁珠的纤维素对DNA的特异性吸附，在磁场和洗脱液的作用下分离并获取DNA，易于自动化，DNA磁珠提取法优点很多，但此方法提取的DNA浓度和纯度易受磁珠的残留量、裂解时间、全血量及酶量的影响，这些因素通过交互作用产生影响，导致DNA浓度不稳定、纯度不高进而影响HLA分型结果信噪比（N/S）合格率低、分型结果成功率低，同时，试剂用量大，测试成本高，测试时间长。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足而提供一种基于改良磁珠法快速提取全血中基因组DNA的方法，本专利技术使用磁珠法自动提取系统从全血中提取基因组DNA，利用DNA定量仪测定DNA浓度与纯度，利用测序仪对PCR扩增产物进行测序，相关的分析软件进行HLA分型结果分析，本专利技术具有DNA浓度均一性强、纯度高、HLA分型结果成功率大幅度提高和信噪比合格率高的特点。本专利技术公开了一种基于改良磁珠法快速提取全血中基因组DNA的方法，其特征在于，该方法具体包括步骤如下：（1）红细胞裂解在容积为2ml离心管中加入450-500μl红细胞裂解液，将120-150μl完全解冻后的全血样本加入上述离心管中，充分振荡，混匀至细胞碎片均匀悬浮，未见成团聚集，将裂解液×10,000rmp离心1-3min，除去上清液。（2）白细胞裂解及DNA吸附将蛋白酶K原液倍比稀释，吸取20μl蛋白酶K及120-150μlLysisBuffer加入以上离心管中，并反复吹打混匀3次后65℃孵育，振荡2-3min静止5-8min，振荡与静止交替进行3个循环；加入250-300μl的BindingBuffer和20-30μl的MagneticBeads置离心管中，抽打混匀或振荡混匀3min；室温离心管架放置3min；将离心管放置磁力架上静置20秒，待磁珠完全吸附时去除液体。（3）DNA纯化将上述离心管从磁力架上取下，加入600-800μl的Wash1Buffer，抽打混匀或振荡混匀至磁珠悬浮，未见成团成片；将离心管放置磁力架上静置20秒，待磁珠完全吸附时去除液体；将离心管从磁力架上取下，加入600-800μl的Wash2Buffer，抽打混匀或振荡混匀至磁珠悬浮，未见成团成片；将离心管放置磁力架上静置20秒，待磁珠完全吸附时去除液体；将离心管从磁力架上取下，加入500-600μl的ddH2O，抽打混匀或振荡混匀至磁珠悬浮，未见成团成片；将离心管放置磁力架上静置20秒，待磁珠完全吸附时去除液体；将离心管放置磁力架上，室温晾干10～15min。（4）DNA洗脱将上述室温晾干后的离心管从磁力架上取下，加入80～100μl的ElutionBuffer，抽打混匀或振荡混匀，置于65℃，孵育8min；将离心管放置磁力架上静置20秒，待磁珠完全吸附时得到DNA溶液，并将DNA溶液转移至收集管中，并-20℃或-80℃保存。优选地，所述的红细胞裂解液加入量为480μl。优选地，所述的完全解冻后的全血样本加入量为130μl。优选地，所述的Wash1Buffer加入量为700μl。优选地，所述的Wash2Buffer加入量为700μl。优选地，所述的ddH2O加入量为550μl。本专利技术与现有技术相比具有如下优点和有益效果：（1）本专利技术所得DNA浓度的均一性、纯度均优于改良前；HLA分型结果中HLA-A、B位点成功率高于改良前；（2）本专利技术得到的HLA信噪比（N/S）合格率均高于改良前、分型胶图反应格局均优于改良前；（3）本专利技术提取DNA法用于HLA测序分型具有稳定、可靠强，同时具有快速、高通量化的特点；（4）测试的时间短，试剂的用量小，测试成本大幅度降低。附图说明附图1为方法改良前后标本A1的DNA参数散点三维图；附图2为方法改良前后标本B1的DNA参数散点三维图；附图3为方法改良前后标本C1的DNA参数散点三维图。具体实施方式下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本专利技术。应理解，这些实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何方式限制本专利技术的范围。实施例1全血样标本A1来自中华骨髓库湖北分库干细胞捐献者血样。利用本专利技术的方法对上述全血样标本A1的DNA进行检测，具体步骤如下：（1）红细胞裂解在容积为2ml离心管中加入500μl红细胞裂解液，将120μl完全解冻后的全血样本加入上述离心管中，充分振荡，混匀至细胞碎片均匀悬浮，未见成团聚集，将裂解液×10,000rmp离心1min，除去上清液。（2）白细胞裂解及DNA吸附将蛋白酶K原液倍比稀释，吸取20μl蛋白酶K及140μlLysisBuffer加入以上离心管中，并反复吹打混匀3次后65℃孵育，振荡2min静止8min，振荡与静止交替进行3个循环；加入250μl的BindingBuffer和25μl的MagneticBeads置离心管中，抽打混匀或振荡混匀3min；室温离心管架放置3min；将离心管放置磁力架上静置20秒，待磁珠完全吸附时去除液体。（3）DNA纯化将上述离心管从磁力架上取下，加入600μl的Wash1Buffer，抽打混匀或振荡混匀至磁珠悬浮，未见成团成片；将离心管放置磁力架上静置20秒，待磁珠完全吸附时去除液体；将离心管从磁力架上取下，加入800μl的Wash2Buffer，抽打混匀或振荡混匀至磁珠悬浮，未见成团成片；将离心管放置磁力架上静置20秒，待磁珠完全吸附时去除液体；将离心管从磁力架上取下，加入500μl的ddH2O，抽打混匀或振荡混匀至磁珠悬浮，未见成团成片；将离心管放置磁力架上静置20秒，待磁珠完全吸附时去除液体；将离心管放置磁力架上，室温晾干10min。（4）DNA洗脱将上述室温晾干后的离心管从磁力架上取下，加入80μl的ElutionBuffer，抽打混匀或振荡混匀，置于65℃，孵育8min；将离心管放置磁力架上静置20秒，待磁珠完全吸附时得到DNA溶液，并将DNA溶液转移至收集管中，并-20℃或-80℃保存。方法改良前后标本A1的DNA参数散点三维图见附图1；方法改良前后标本A1的HLA-A、B、DRB1分型成功率见表1；方法改良前后标本A1的HLA-B第二外显子信噪比（N/S）合格率见表2。表1方法改良前后标本A1的HLA-A、B本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于改良磁珠法快速提取全血中基因组DNA的方法，其特征在于，该方法具体包括步骤如下：（1）红细胞裂解在容积为2ml离心管中加入450‑500µl红细胞裂解液，将120‑150µl完全解冻后的全血样本加入上述离心管中，充分振荡，混匀至细胞碎片均匀悬浮，未见成团聚集，将裂解液×10,000rmp离心1‑3min，除去上清液；（2）白细胞裂解及DNA吸附将蛋白酶K原液倍比稀释，吸取20µl蛋白酶K及120‑150µl Lysis Buffer加入以上离心管中，并反复吹打混匀3次后65℃孵育，振荡2‑3min静止5‑8min，振荡与静止交替进行3个循环；加入250‑300µl的Binding Buffer和20‑30µl的Magnetic Beads置离心管中，抽打混匀或振荡混匀3min；室温离心管架放置3min；将离心管放置磁力架上静置20秒，待磁珠完全吸附时去除液体；（3）DNA纯化将上述离心管从磁力架上取下，加入600‑800µl的Wash1Buffer，抽打混匀或振荡混匀至磁珠悬浮，未见成团成片；将离心管放置磁力架上静置20秒，待磁珠完全吸附时去除液体；将离心管从磁力架上取下，加入600‑800µl的Wash2Buffer，抽打混匀或振荡混匀至磁珠悬浮，未见成团成片；将离心管放置磁力架上静置20秒，待磁珠完全吸附时去除液体；将离心管从磁力架上取下，加入500‑600µl的ddH2O，抽打混匀或振荡混匀至磁珠悬浮，未见成团成片；将离心管放置磁力架上静置20秒，待磁珠完全吸附时去除液体；将离心管放置磁力架上，室温晾干10～15min；（4）DNA洗脱将上述室温晾干后的离心管从磁力架上取下，加入80～100µl的Elution Buffer，抽打混匀或振荡混匀，置于65℃，孵育8min；将离心管放置磁力架上静置20秒，待磁珠完全吸附时得到DNA溶液，并将DNA溶液转移至收集管中，并‑20℃或‑80℃保存。...
【技术特征摘要】
1.一种基于改良磁珠法快速提取全血中基因组DNA的方法，其特征在于，该方法具体包
括步骤如下：
（1）红细胞裂解
在容积为2ml离心管中加入450-500μl红细胞裂解液，将120-150μl完全解冻后的全血
样本加入上述离心管中，充分振荡，混匀至细胞碎片均匀悬浮，未见成团聚集，将裂解液×
10,000rmp离心1-3min，除去上清液；
（2）白细胞裂解及DNA吸附
将蛋白酶K原液倍比稀释，吸取20μl蛋白酶K及120-150μlLysisBuffer加入以上离心
管中，并反复吹打混匀3次后65℃孵育，振荡2-3min静止5-8min，振荡与静止交替进行3个循
环；加入250-300μl的BindingBuffer和20-30μl的MagneticBeads置离心管中，抽打混匀
或振荡混匀3min；室温离心管架放置3min；将离心管放置磁力架上静置20秒，待磁珠完全吸
附时去除液体；
（3）DNA纯化
将上述离心管从磁力架上取下，加入600-800μl的Wash1Buffer，抽打混匀或振荡混匀
至磁珠悬浮，未见成团成片；将离心管放置磁力架上静置20秒，待磁珠完全吸附时去除液
体；将离心管从磁力架上取下，加入600-800μl的Wash2Buffer，抽打混匀或振荡混匀至磁珠
悬浮，未见成团成片；将离心管放置磁力架上静置20秒，待磁珠完全吸附时去除液体；...
【专利技术属性】
技术研发人员：李王霞，沈钢，李刚，姚立，马严，仇丰武，江梦天，刘光箭，邹洁，朱远雁，
申请(专利权)人：武汉血液中心，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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