本发明专利技术涉及一种甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝二乙胺修饰的高容量琼脂糖凝胶色谱介质及制备方法与应用。通过表面引发剂α‐溴异丁酰溴和单体甲基丙烯酸缩水甘油酯用量的调控，获得接枝密度和链长度均不同的介质，然后用二乙胺对单体上的环氧基进行修饰，得到阴离子交换色谱介质。本发明专利技术合成的甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝二乙胺修饰色谱介质对牛血清蛋白的饱和吸附容量可高达264mg/mL,在10％穿透条件下DBC超过90mg/mL。该介质制备方法简单，接枝条件可控，在蛋白质高效分离纯化中将有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝二乙胺修饰的以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质及制备方法与应用，属于生物
中的蛋白质色谱分离技术。
技术介绍
在基因工程和重组DNA等上游生物技术取得巨大进展的同时，生物大分子生产的瓶颈在于下游分离纯化技术。色谱技术尤其是离子交换色谱，因其分离精度高，设备简单，操作方便，广泛用于生物大分子的分离和纯化。离子交换色谱作为一种成熟的色谱分析方法，仍有飞快的发展速度和巨大的发展空间。在蛋白质色谱技术的各项要素中，色谱介质是核心，研究和开发新型高效的色谱介质是提高色谱分离效率的关键。因此，开发高效的新型离子交换剂，是离子交换色谱最具前景的发展趋势。由于目前蛋白质色谱介质的处理能力严重滞后，提高离子交换色谱介质吸附容量已经成为当前实现蛋白质离子交换过程高效化的重要前提之一。其中，接枝型色谱介质作为实现理想化色谱介质的途径，成为了近年来的研究热点。通过在传统介质表面接枝上带有活性基团的聚合物长链，可以使吸附行为从介质表面扩展到三维空间，形成多层吸附，从而达到提高色谱介质吸附容量的目的。因此，通过接枝聚合反应，可以有效提高大孔型介质对生物大分子的吸附容量。虽然，葡聚糖、聚乙烯亚胺等接枝修饰介质的开发，大幅度提高了蛋白质的吸附容量和传质速率。但是葡聚糖、聚乙烯亚胺等接枝介质为聚合物直接接枝，聚合物分子的分子量不均一且其在基质介质上的接枝为多位点结合，因此接枝过程难以控制和优化，进而限制了其在工业上的应用。针对上述的缺陷，研究者们采用多种接枝方法应用于离子交换色谱介质的制备。其中，原子转移自由基聚合(ATRP)技术是一种表面引发的自由基聚合方法，具有聚合工艺简单，聚合过程易控制，接枝链分子量分布窄，以及聚合实施方法多样等显著优点，是目前为止最具工业化应用前景的聚合方法之一。近年来，ATRP技术逐渐被用于色谱介质的制备。Unsal等人率先报道了采用ATRP技术制备蛋白质层析介质的方法【AnalyticalChemistry,2006,78(16):5868-5875.】。该方法以3-(2-Bromoisobutyramido)propyl(triethoxy)silane(BIBAPTES)为引发剂在平均孔径约为50nm的甲基丙烯酸二羟基丙酯(dihydroxypropylmethacrylate)与二甲基丙烯酸乙酯(ethylenedimethacrylate)共聚微球上接枝单体化合物甲基丙烯酸3-磺酸丙酯钾盐(3-sulfopropylmethacrylatepotassiumsalt)合成聚合物接枝离子交换色谱介质。合成的离子交换层析介质具有较好的色谱性能，但在较宽聚合度范围(2.2–25.1)内未表现出对蛋白质吸附容量的改善。ShuLi利用ATRP技术合成的接枝型离子交换微球具有高吸附容量以及快速吸附等优点【BiochemicalEngineeringJournal,2015,103:122-129.】。基于上述的思路，本专利技术利用ATRP技术在琼脂糖凝胶介质表面接枝单体化合物甲基丙烯酰缩水甘油酯并修饰二乙胺合成用于蛋白质吸附和分离纯化的色谱介质。通过控制反应条件合成不同接枝密度和接枝链长的阴离子交换介质。
技术实现思路
本专利技术的目的在于开发一种接枝型阴离子交换色谱介质。所述的分离纯化色谱介质具有吸附容量大的特点，其制备方法过程简单，接枝密度和接枝链长可调节。本专利技术的技术方案概述如下：一种介质表面接枝聚电解质提高蛋白质吸附容量的方法，该色谱介质是平均粒径为50-120μm的琼脂糖凝胶颗粒，接枝链为二乙胺修饰的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯。色谱介质的结构表达形式如下：本专利技术的接枝型阴离子交换色谱介质，该色谱介质是在琼脂糖凝胶多孔介质表面接枝带有活性环氧基的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯长链，然后修饰二乙胺获得阴离子交换色谱介质。接枝链的重复单元为二乙胺修饰的甲基丙烯酸缩水甘油酯。本专利技术的阴离子交换色谱介质的制备方法，包括以下过程：1)介质的溴化反应将平均粒径为50-120μm的琼脂糖凝胶多孔介质经溶剂替换再悬浮于N,N’-二甲基甲酰胺溶液中，N,N’-二甲基甲酰胺的体积用量为介质体积的5-8倍，继而向悬浮液中加入体积用量为介质体积0.2-0.5倍的三乙胺混合，在冰浴条件下向混合悬浮液中滴加入体积用量为介质体积0.025-0.33倍的α-溴异丁酰溴，置于25-40℃的恒温水浴中反应10-16h，之后依次用N,N’-二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水清洗介质，得到溴化介质；2)介质的ATRP接枝反应将溴化介质悬浮于N,N’-二甲基甲酰胺与水的混合溶液中，混合溶液的体积用量为溴化介质体积的6-8倍；再向该悬浮液中加入单体甲基丙烯酸缩水甘油酯、溴化铜和2,2’-联吡啶，通氮气除氧，再向悬浮液中加入溴化亚铜，继续通氮气，反应60-120min；将反应液暴露于空气中使溴化亚铜被氧化以终止反应，用EDTA清洗除去铜离子，用乙醇和大量去离子水清洗介质，得到GMA接枝介质；3)介质的胺基化修饰反应将GMA接枝介质置于20％二乙胺水溶液中，体积用量为接枝介质体积的7-12倍，20-30℃，170rpm反应5-12h，使接枝链上的环氧基被DEA充分修饰，用去离子水反复冲洗，直到清洗液用酚酞检测不变色，得到聚合物接枝型阴离子交换介质。所述步骤2中，将溴化介质悬浮于N,N’-二甲基甲酰胺与水的混合溶液中，N,N’-二甲基甲酰胺与水的体积比为1:1。所述步骤3中，悬浮液中加入量以每毫升介质计：单体甲基丙烯酸缩水甘油酯量为0.15-1.5mmol/mL介质；溴化亚铜加入量为0.02-0.06mmol/mL介质；溴化亚铜、溴化铜与联吡啶的摩尔比为1:0.1:5。按上述方法所得介质的溴化密度为1-40mmol/L，接枝密度呈现梯度变化；介质的离子交换容量为140-550mmol/L；同一接枝密度的介质离子交换容量各不相同，即同一接枝密度的介质接枝链长不同。本专利技术得到的甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝二乙胺修饰的以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质应用于蛋白质分离纯化中，提升蛋白质的静态吸附容量和动态吸附容量。本专利技术的关键技术有三点：首先，α-溴异丁酰溴用量的选择，得到接枝密度呈现明显梯度变化的介质；其次，单体甲基丙烯酸缩水甘油酯用量的控制，从而获得在同一接枝密度下不同链长的介质；最后，二乙胺浓度和用量的确定，以保证接枝的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯上的环氧基被充分修饰。本专利技术的优点：经实验证明，通过调节甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝二乙胺修饰型介质的接本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝二乙胺修饰琼脂糖凝胶色谱介质，其特征是该色谱介质是在琼脂糖凝胶多孔介质表面接枝带有活性环氧基的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯长链，然后修饰二乙胺获得阴离子交换色谱介质。
【技术特征摘要】
1.一种甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝二乙胺修饰琼脂糖凝胶色谱介质，其特征是该色谱介质是
在琼脂糖凝胶多孔介质表面接枝带有活性环氧基的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯长链，然后修饰
二乙胺获得阴离子交换色谱介质。
2.按权利要求1所述的色谱介质，其特征在于接枝链的重复单元为二乙胺修饰的甲基丙烯酸
缩水甘油酯。
3.制备权利要求1所述的色谱介质的方法，其特征在于包括以下过程：
1)介质的溴化反应
将平均粒径为50-120μm的琼脂糖凝胶多孔介质经溶剂替换再悬浮于N,N’-二甲基甲酰胺
溶液中，N,N’-二甲基甲酰胺的体积用量为介质体积的5-8倍，继而向悬浮液中加入体积用量
为介质体积0.2-0.5倍的三乙胺混合，在冰浴条件下向混合悬浮液中滴加入体积用量为介质体
积0.025-0.33倍的α-溴异丁酰溴，置于25-40℃的恒温水浴中反应10-16h，之后依次用N,N’-
二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水清洗介质，得到溴化介质；
2)介质的ATRP接枝反应
将溴化介质悬浮于N,N’-二甲基甲酰胺与水的混合溶液中，混合溶液的体积用量为溴化介
质体积的6-8倍；再向该悬浮液中加入单体甲基丙烯酸缩水甘油酯、溴化铜和2,2’-联吡啶，
通氮气除氧，再向悬浮液中加入溴化亚铜，继续通氮气，反应60-120min；将反应液暴露于
空气中使溴化亚铜被氧化以终...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙彦，王倩倩，余林玲，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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