本发明专利技术公开了一种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的ARMS引物，其特征在于，所述ARMS引物的序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.31所示。本发明专利技术还公开了含有上述ARMS引物。本发明专利技术在ARMS实时荧光定量技术中引入了双内参系统，除了一般的内参对照外，还增加了和突变位点一致的正常位点参照，双内参系统和对应的双重判读规则避免了现有技术的缺陷，提高了检测的准确性，减少了错误率；而且本发明专利技术的检测试剂盒中还含有用于对样品进行桑格测序的试剂，联合桑格测序技术和ARMS实时荧光定量技术，既能对已知基因的突变位点进行检测，又能发现新的突变位点，保证了检测的灵敏度。
【技术实现步骤摘要】
[00011本专利技术涉及一种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的引物及其试剂盒，属于分子生 物学检测
技术介绍
根据世界肿瘤研究治疗领域权威机构NCCN推荐，肺癌患者，尤其是非小细胞肺癌 (NSCLC)患者，建议进行EGFR基因突变检测。EGFR激活突变的存在对选择治疗用抗癌药物具 有重要作用。而研究表明，EGFR的某些突变，尤其是它的19号外显子缺失突变，21号外显子 点突变(L858R)，18号外显子点突变，20号外显子的点突变(T790M)，与络氨酸激酶抑制剂 (TKIs)的疗效有高度的相关性。此外，在部分肺癌病人当中，同时存在着EGFR基因和KRAS基 因的突变，而KRAS基因第2，3，4号外显子上的突变与络氨酸激酶抑制剂(TKI s)的疗效有负 相关作用，当KRAS基因存在这些类型突变时，会对靶向EGFR的靶向抗癌药物产生抵抗。同 时，BRAF基因在肺癌当中也存在不同程度的突变。这些突变中最主要的是第1799位核苷酸 上的突变，导致缬氨酸突变成谷氨酸(V600E)，使患者对抗体类药物(如西妥昔单抗)产生抗 药性。因此，检测EGFR、BRAF、KRAS基因的突变情况对指导临床肿瘤用药具有重要作用。 在检测人组织细胞样本中EGFR、KRAS、BRAF基因突变的现有技术中，通常采用探针 技术对上述基因突变进行检测（如厦门艾德生物医药科技有限公司生产的EGFR基因检测试 剂盒）。采用荧光探针技术虽然能够提高检测的特异性，但是使用成本过高，同时无法检测 新型突变。另外采用荧光探针，通过突变组探针荧光起峰的Ct值大小进行判断的方法，其缺 陷在于没有有效参照物，虽然引入了内参，但是内参与突变位点并不是同一位点，甚至不是 同一种基因。而且，其Ct值的判断规则基于经验值，因此在检测时由于样本提取质量等因 素，其检测效果并不理想，在实际应用中，可能会出现检测结果的不一致。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的 引物试剂盒。本专利技术的试剂盒采用ARMS-PCR技术对上述基因突变进行检测，在ARMS-PCR技 术中采用SYBR荧光方法，能够大幅降低成本;同时通过优化引物设计，在荧光收集阶段引入 四步法(81°C收集荧光），采用高性能的DNA聚合酶，最大限度减少非特异干扰，提高检测的 可靠性和准确性。 此外，本专利技术的试剂盒还引入了双内参系统，提供了双重判读规则，提高了检测的 准确性和灵敏度。 本专利技术中，所述EGFR、KRAS、BRAF基因突变的突变位点信息如下：ID NO .33所示。 所述ARMS引物中，用于扩增正常位点的引物和共用引物扩增得到对应突变位点的 正常基因位点，作为第二内参。 上述试剂盒中，还包括如下试剂:DNA聚合酶、10 X DNA聚合酶缓冲液、SYBR-Green-I、高纯水、阳性对照品和4种dNTP混合物。 优选的，所述DNA聚合酶为Taq HS DNA聚合酶。 进一步的，上述试剂盒中还包括用于对样品进行桑格测序的试剂，所述试剂中包 含用于扩增EGFR、KRAS和BRAF基因中任意一个、两个或全部的一个或多个外显子区域的扩 增引物对。 其中，用于扩增EGFR基因的外显子18的区域的扩增引物对如SEQ ID N0.34和SEQ ID NO .35所示； 用于扩增EGFR基因的外显子19的区域的扩增引物对如SEQ ID NO.36和SEQ ID NO. 37所示； 用于扩增EGFR基因的外显子20的区域的扩增引物对如SEQ ID NO.38和SEQ ID NO. 39所示； 用于扩增EGFR基因的外显子21的区域的扩增引物对如SEQ ID NO.40和SEQ ID NO. 41所示； 用于扩增KRAS基因的外显子2的区域的扩增引物对如SEQ ID NO. 42和SEQ ID NO. 43所示； 用于扩增KRAS基因的外显子3的区域的扩增引物对如SEQ ID NO. 44和SEQ ID NO. 45所示； 用于扩增KRAS基因的外显子4的区域的扩增引物对如SEQ ID NO. 46和SEQ ID NO. 47所示； 用于扩增BRAF基因的外显子15的区域的扩增引物对如SEQ ID NO.48和SEQ ID NO. 49所示。 所述用于对样品进行桑格测序的试剂中，还包含对EGFR、KRAS和BRAF基因扩增产 物进行测序的测序引物；其序列分别如SEQ ID N0.34、SEQ ID N0.37、SEQ ID N0.39、SEQ ID N0.41、SEQ ID N0.43、SEQ ID N0.44、SEQ ID N0.46和SEQ ID N0.48所示。 作为一种具体的应用形式，上述试剂盒的组成包括：用于检测人EGFR、KRAS、BRAF 基因突变的ARMS引物、Taq HS DNA聚合酶、Taq HS DNA聚合酶10X缓冲液、SYBR-Green-I (1:30000)、高纯水、阳性对照品、4种dNTP混合物和用于对样品进行桑格测序的试剂。上述试剂盒在制备检测或辅助检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的产品中的应用 也属于本专利技术的保护范围。本专利技术进一步提供一种非诊断目的的利用上述试剂盒检测人EGFR、KRAS、BRAF基 因突变的方法，采用上述ARMS引物对待测样品的目的基因进行PCR扩增，在81°C采集荧光信 号，根据Ct值对检测结果进行判读，若ACt-l ? ACt_2(差别在1个循环内），ACt_2>8,则检 测结果为阴性； 若ACt-l>ACt_2, ACt_2〈8,则检测结果为阳性。 进一步的，若Δ ct_2〈4,则为强阳性;如果4〈 Δ ct_2〈8,则为弱阳性。 其中，ACt-l:突变组Ct值减去第一内参组Ct值； ACt-2:突变组Ct值减去第二内参组Ct值。 上述方法，所述PCR扩增的条件为:95°C预变性3分钟；按95°C20秒，68°C25秒，72°C 25秒，扩增反应15个循环;再按95°C20秒，64°C20秒，72°C20秒，81°C20秒，扩增反应30个循 环。本专利技术的有益效果： (1)本专利技术在ARMS实时荧光定量技术中引入了双内参系统，除了一般的内参对照 外，还增加了和突变位点一致的正常位点参照，即与对应的突变位点一致的正常基因位点 作为第二内参，这样能够确保检测的一致性。双内参系统和对应的双重判读规则避免了现 有技术的缺陷，判读基于综合判断，并不依赖经验值，能够给出更可靠的突变比例数据，提 高了检测的准确性，减少了错误率。 (2)本专利技术在ARMS实时荧光定量技术中，采用SYBR荧光方法，能够大幅降低检测的 成本，同时通过优化引物设计，在荧光收集阶段引入四步法(81度收集荧光），采用高性能的 DNA聚合酶，最大限度减少非特异干扰，提高检测的可靠性和准确性。 (3)本专利技术的检测试剂盒中，联合桑格测序技术和ARMS实时荧光定量技术，既能对 已知基因的突变位点进行检测，又能发现新的突变位点，保证了检测的灵敏度和准确度。【附图说明】 图1:EGFR Exon-19-ARMS已知阳性样本实时荧光定量扩增曲线图； 图2:KRAS Exon-2-ARMS已知阳性样本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的ARMS引物，其特征在于，所述ARMS引物的序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.31所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄理，刘海云，李保伟，
申请(专利权)人：济南银丰医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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