用于检测海洋致病菌的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了用于检测海洋致病菌的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用，特点是将海洋致病菌抗体固载到氨基化磁珠表面得到表面覆盖有海洋致病菌抗体的免疫磁珠溶液的步骤；海洋致病菌抗体和电化学发光体同时化学键合的多功能化氧化石墨烯的合成步骤；电极预处理以及将免疫磁珠固载磁性玻碳电极表面的步骤；最后将待测海洋致病菌、多功能化氧化石墨烯依次吸附于磁性玻碳电极表面即可，将得到夹心式电化学发光免疫传感器作为工作电极；采用铂电极作为对电极，Ag/AgCl电极或者饱和甘汞电极作为参比电极，即可计算得到待测样品溶液中海洋致病菌的准确浓度，优点是检测速度快、检测结果灵敏度和准确性高、特异性强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及电化学发光免疫传感器，尤其是涉及用于检测海洋致病菌的夹心式电 化学发光免疫传感器的制备方法及其应用。
技术介绍
海洋致病菌是一种原核单细胞生物，呈球状、杆状、螺旋状等。海洋致病菌会导致 海洋水产动植物患病，例如：副溶血弧菌可引起凡纳滨对虾幼虾发生毁灭性死亡。一些海洋 致病菌是人畜共患病的重要病原，人类通过进食受污染的海产品或破损的皮肤接触海水感 染致病菌，可引发中耳炎、泌尿系统感染、败血症等疾病甚至死亡。因此快速准确地检测海 洋致病菌是保护人类健康和减少经济损失的重要途径。 目前对于海洋致病菌的测定，常规培养方法包括增菌培养、选择性培养等过程，耗 时长、操作繁琐、检出率低。以免疫学为基础的检测方法利用抗原抗体识别的特异性，包括 酶联免疫吸附（ELISA)法等，但是灵敏度需要进一步提高。基于核酸的检测方法如聚合酶 链式反应（PCR)是一种灵敏的检测方法，但较易出现假阳性结果。因此，开发快速、灵敏、准 确、操作简便的海洋致病菌检测技术非常重要。 电化学发光（Electrochemiluminescence，ECL)是一种在电极表面由电化学引发 的化学发光反应，是化学发光与电化学相结合的产物。电化学发光免疫传感器是集电化学 发光与免疫传感器为一体的技术，具有灵敏度高、操作简便等优点。氧化石墨烯是一种性能 优异的新型碳材料，具有较高的比表面积和丰富的官能团，基于氧化石墨烯制备的功能化 氧化石墨烯，可有效延展电极表面的赫姆霍兹面，显著增强电化学发光，提高灵敏度，是构 建电化学发光传感器标记物的理想材料。免疫磁珠是近年来发展起来的一项免疫学技术， 它将固化试剂特有的优点与免疫学反应的高度特异性结合于一体，运用核-壳的合成方法 合成超顺磁性功能化四氧化三铁小球，利用其表面基团与抗体进行偶联，可结合相应的抗 原。目前以免疫磁珠捕获细菌，以多功能化氧化石墨烯为标记物，用于检测海洋致病菌的夹 心式电化学发光免疫传感器未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测速度快、检测结果灵敏度和准确性 高、特异性强的用于检测海洋致病菌的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法及其应 用。 本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测海洋致病菌的夹心 式电化学发光免疫传感器的制备方法，包括以下步骤： (1)免疫磁珠的合成 在干净的烧瓶中加入5~IOmg的氨基化磁珠，再加入2~5mL含有3wt%戊二醛 的0· lmol/L pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液，37°C孵育3h后，外加磁铁磁性分离后用0· Imol/ L pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3~5次，去除上清液后，0. lmol/L pH 7. 4的磷酸盐缓冲 溶液定容至2~5mL ;加入50~150 μ L 0. 5mg/mL海洋致病菌一抗溶液，37°C孵育lh，外 加磁铁磁性分离后用0. lmol/L pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3~5次，去除上清液后，用 0. lmol/L pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液定容至2~5mL;加入2wt%的牛血清白蛋白溶液50~ 150 μ L以封闭非特异性活性位点，37°C孵育lh，外加磁铁磁性分离后用0. lmol/L pH 7. 4 的磷酸盐缓冲溶液洗涤3~5次，去除上清液后，用0. lmol/L pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液定 容至2~5mL，即可得到表面覆盖有海洋致病菌抗体的免疫磁珠溶液，4°C下储存备用； ⑵多功能化氧化石墨烯的合成 在干净的试管中加入150~250 μ L的lmg/mL氧化石墨稀（GO)，超声lh，然后加 入100~300 μ L偶联试剂，混合均匀，同时滴加0. lmol/L稀盐酸至溶液pH = 4~6,振荡 孵育Ih后，8000r离心15min，去除上清液后，0. lmol/L pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液定容至 0· 5~ImL ;加入40~60 μ L 10 5~0· 001mol/L电化学发光体溶液和40~60 μ L 0· 01~ 0. lmg/mL海洋致病菌二抗溶液，混合均勾，同时滴加0. lmol/L氢氧化钠溶液至溶液pH = 8~10,常温振荡孵育4h，8000r离心15min，去除上清液后，用0. lmol/L pH 7. 4的磷酸盐 缓冲溶液定容至〇. 5~ImL ;再加入2wt %的牛血清白蛋白溶液80~120 μ L以封闭非特异 性活性位点，常温振荡孵育lh，8000r离心15min，去除上清液后，用0. lmol/L pH 7. 4的磷 酸盐缓冲溶液定容至〇. 5~lmL，即可得到海洋致病菌抗体和电化学发光体同时化学键合 的多功能化氧化石墨烯溶液，4°C下储存备用； ⑶电极修饰 将直径为3~5mm的磁性玻碳电极依次用1. 0 μ m、0. 3 μ m、0. 05 μ m的三氧化二铝 浆液抛光处理，用乙醇、水依次超声2min，洗净，氮气吹干；取5~10 μ L步骤（1)得到的免 疫磁珠溶液，滴涂于处理过的磁性玻碳电极中心，免疫磁珠即被均匀地牢固吸附在电极表 面；用水洗净后即得固载有免疫磁珠的磁性玻碳电极； (4)夹心式电化学发光免疫传感器的组装 将步骤（3)所得的固载有免疫磁珠的磁性玻碳电极浸泡在含有待测海洋致病菌 的溶液中，37°C下孵育Ih ;清洗后，再滴涂5~10 μ L步骤（2)得到的多功能化氧化石墨烯 溶液中，37°C下孵育Ih ;清洗后，即组装成用于检测海洋致病菌的夹心式电化学发光免疫 传感器。 所述的电化学发光体为含氨基官能团的三联吡啶钌衍生物，溶剂为0. lmol/L pH =7· 4 的 Tris-HCl 缓冲液。 所述的偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基）-3_乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC)与N-羟 基琥珀酰亚胺（NHS)按摩尔比10 :1混合后溶于水中得到，所述的偶联试剂中1-(3-二甲氨 基丙基）-3_乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC)的摩尔浓度为10~100mmol/L，所述的N-羟基琥 珀酰亚胺（NHS)摩尔浓度为1~10mmol/L。 所述的磷酸盐溶液为Na2HPO4 · UH2O-NaH2PO4 · 2H20体系缓冲溶液。 所述的海洋致病菌为副溶血弧菌（VP)、创伤弧菌（VV)、哈维氏弧菌（VH)、阴沟肠 杆菌（EC)或黄海希瓦氏菌（SM)。 利用上述夹心式电化学发光免疫传感器检测海洋致病菌的方法，具体步骤如下： 将上述夹心式电化学发光免疫传感器作为工作电极；采用铂电极作为对电极，Ag/AgCl电 极或者饱和甘汞电极作为参比电极，构成三电极体系；将上述三电极体系放入含共反应试 剂的缓冲溶液，启动电化学反应，测量电化学发光强度，获得待测海洋致病菌溶液对应的电 化学发光强度值；根据电化学发光强度值与海洋致病菌溶液浓度对数之间的定量关系可计 算得到待测样品溶液中海洋致病菌的准确浓度。 所述的含共反应试剂的缓冲溶液为含20~40mmol/L的三丙胺的0. lmol/L pH 7 ~8 的 Na2HPO4 · 12H20-NaH2P04 · 2H20 体系缓冲溶液。 所述的电化学反应的条件如下：电位阶跃计时电流法，脉冲宽度：0. 25秒；脉冲间 隔：30秒；初始电压：1V ;脉冲电压：1. 5V。 原理本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测海洋致病菌的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)免疫磁珠的合成在干净的烧瓶中加入5～10mg的氨基化磁珠，再加入2～5mL含有3wt％戊二醛的0.1mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液，37℃孵育3h后，外加磁铁磁性分离后用0.1mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3～5次，去除上清液后，0.1mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液定容至2～5mL；加入50～150μL 0.5mg/mL海洋致病菌一抗溶液，37℃孵育1h，外加磁铁磁性分离后用0.1mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3～5次，去除上清液后，用0.1mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液定容至2～5mL；加入2wt％的牛血清白蛋白溶液50～150μL以封闭非特异性活性位点，37℃孵育1h，外加磁铁磁性分离后用0.1mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3～5次，去除上清液后，用0.1mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液定容至2～5mL，即可得到表面覆盖有海洋致病菌抗体的免疫磁珠溶液，4℃下储存备用；(2)多功能化氧化石墨烯的合成在干净的试管中加入150～250μL的1mg/mL氧化石墨烯，超声1h，然后加入100～300μL偶联试剂，混合均匀，同时滴加0.1mol/L稀盐酸至溶液pH＝4～6，振荡孵育1h后，8000r离心15min，去除上清液后，0.1mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液定容至0.5～1mL；加入40～60μL 10‑5～0.001mol/L电化学发光体溶液和40～60μL 0.01～0.1mg/mL海洋致病菌二抗溶液，混合均匀，同时滴加0.1mol/L氢氧化钠溶液至溶液pH＝8～10，常温振荡孵育4h，8000r离心15min，去除上清液后，用0.1mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液定容至0.5～1mL；再加入2wt％的牛血清白蛋白溶液80～120μL以封闭非特异性活性位点，常温振荡孵育1h，8000r离心15min，去除上清液后，用0.1mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液定容至0.5～1mL，即可得到海洋致病菌抗体和电化学发光体同时化学键合的多功能化氧化石墨烯溶液，4℃下储存备用；(3)电极修饰将直径为3～5mm的磁性玻碳电极依次用1.0μm、0.3μm、0.05μm的三氧化二铝浆液抛光处理，用乙醇、水依次超声2min，洗净，氮气吹干；取5～10μL步骤(1)得到的免疫磁珠溶液，滴涂于处理过的磁性玻碳电极中心，免疫磁珠即被均匀地牢固吸附在电极表面；用水洗净后即得固载有免疫磁珠的磁性玻碳电极；(4)夹心式电化学发光免疫传感器的组装将步骤(3)所得的固载有免疫磁珠的磁性玻碳电极浸泡在含有待测海洋致病菌的溶液中，37℃下孵育1h；清洗后，再滴涂5～10μL步骤(2)得到的多功能化氧化石墨烯溶液中，37℃下孵育1h；清洗后，即组装成用于检测海洋致病菌的夹心式电化学发光免疫传感器。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭智勇，沙玉红，苏秀榕，武琳，张宁，宋信信，贾亚茹，卢静，李温柔，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33