使用绵羊B细胞产生抗体的方法及其用途技术

本文报道了用于在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下培养绵羊B细胞的合并物或单一沉积的绵羊B细胞的培养系统。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】使用绵羊B细胞产生抗体的方法及其用途 本专利申请在B细胞培养领域中。本文报道了这样的培养系统，其用于在佛波醇 肉豆蔻酸酯乙酸酯（phorbolmyristateacetate)存在的情况下刺激和扩增绵羊来源的分 泌抗体的细胞，诸如活化的B细胞、成浆细胞以及分离自免疫的绵羊的B细胞。 专利技术背景 已经报道，来自不同物种的分离的B细胞、成浆细胞和浆细胞难以在体外进行培养。实 践中，这通常通过将原代B细胞与杂交瘤伴侣融合生成永生的B细胞系或永生化来克服。对 于兔，还开发了衆细胞瘤融合伴侣（Spieker-Polet,H·，等人，？1"〇〇.似1:1.4〇3(1.3(3；[· USA92 (1995) 9348-9352)，但杂交瘤技术在兔中不能很好地运行。对于绵羊，也已经描 述了杂交瘤技术（参见例如Osborne,J·，等人，Hybridoma18 (1999) 183 -191)，但这 些杂交瘤倾向于不稳定且具有不良产率。对于B细胞在体外的持续存活，必需提供必要的 活化刺激和存活因子。已经描述了多种化合物，诸如IL-2、IL-4、IL-10和其他（参见例如 Zubler,R·，等人，Eur.J.Immunol. 14 (1984) 357-363，和J.Exp.Med. 160 (1984) 1170-1183)0 在生理学上，Β细胞在遇到特异性抗原加上额外活化之后，例如经由⑶40/⑶40L 途径（综述于N6ron,S.，等人，Arch.Immunol.Ther.Exp. 59 (2011) 25-40)和 / 或 经由源自天然背景的细胞因子和/或生长因子，例如通过树突状细胞或T细胞辅助之后被 活化。 在体外系统中，可以通过与EL4-B5胸腺瘤细胞的共培养或添加可溶性的或固定 化的抗⑶40抗体或⑶40L来模拟⑶40/⑶40L的相互作用。仅有的系统缺少足够的效力并 且仅描述了与使用不同饲养混合物（例如Zubler混合物；IL-4,IL-10,等）（Zubler, R.，上文）或胸腺细胞上清液（TSN)的进一步所需刺激剂的组合。Weitkamp,J-Η.，等人，（J.Immunol. Meth. 275 (2003) 223-237)报道了从用 荧光病毒样颗粒选择的单抗原特异性B细胞生成针对轮状病毒的重组人单克隆抗体。产生 针对多种同源抗原的多种分离抗体的方法报道于US2006/0051348中。用于获得抗原特异 性B细胞的克隆群体的培养方法报道于US2007/0269868中。用于制备免疫球蛋白文库的 方法报道于W0 2007/031550中。Griebel,P.J.，等人报道了克隆未转化的绵羊B细胞（J.Immunol.Meth. 237 (2000) 19-28)。Griebel，P.，等人报道了CD40信号传导诱导了对γ链-常见的细胞因 子家族的多个成员的Β细胞响应性（Int.Immunol. 11 (1999) 1139-1147)。Miyasaka, Μ.和Dudler，L.报道了绵羊未成熟的B细胞在暴露于佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯之后的 分化（Int.Arch.AllergyAppl.Immunol. 74 (1984) 281-283)。Miyasaka,M.，等人 报道了绵羊中B淋巴细胞的分化：I.回肠淋巴集结细胞的表型分析和回肠淋巴集结中的 slg+细胞的前体群体的证明（Immunol. 53 (1984) 515-523)。Sedgmen,B.J·，等人报道 了优化分泌绵羊抗体的细胞测定用于检测外周血白细胞中的抗原特异性免疫球蛋白产生 (Immunol.CellBiol. 81 (2003) 305-310)。 专利技术概述 本文报道了用于从绵羊B细胞开始快速、有效且可重复地生成绵羊抗体且包括至少一 个培养步骤的新方法。 本文进一步报道了佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯（PMA)作为添加剂用于培养绵羊B细 胞以提供高效的绵羊B细胞刺激和培养系统的用途。 如本文报道的一个方面是用于在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯（PMA)存在的情况下/ 与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯（PMA) -起培养绵羊B细胞的方法。 如本文报道的一个方面是用于在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯（PMA)、绵羊TSN和饲 养细胞存在的情况下/与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯（PMA)、绵羊TSN和饲养细胞一起培养绵 羊B细胞的方法。 如本文报道的一个方面是用于在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯（PMA)存在的情况下/ 与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯（PMA) -起共培养绵羊B细胞和饲养细胞的方法。 如本文报道的一个方面是用于产生绵羊抗体的方法，其包括在佛波醇肉豆蔻酸酯 乙酸酯（PMA)存在的情况下/与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯（PMA) -起培养分泌抗体的绵羊 B细胞和从培养上清液回收所述抗体、从而产生绵羊抗体的步骤。 在一个实施方案中，所述绵羊B细胞是幼稚绵羊B细胞或未成熟绵羊B细胞。 在一个实施方案中，所述B细胞是IgG阳性的B细胞（IgG+)。IgG阳性的B细胞 递呈可以检测和标记的细胞表面标志物IgG。 在一个实施方案中，所述B细胞是IgG阳性和⑶45R阳性的B细胞（IgG+⑶45R+)。 IgG阳性的B细胞递呈可以检测和标记的细胞表面标志物IgG。 在一个实施方案中，所述B细胞是IgG阳性和⑶21阳性的B细胞（IgG+⑶2Γ)。 IgG阳性的B细胞递呈可以检测和标记的细胞表面标志物IgG。 如本文报道的一个方面是用于产生特异性结合至抗原的抗体的方法，其包括以下 步骤： a) 在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯（PMA)存在的情况下/与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯 (PMA) -起培养分泌抗体的绵羊B细胞的合并物或单一沉积的分泌抗体的绵羊B细胞， b) 分离编码抗体的可变轻链结构域的氨基酸序列的核酸且分离编码抗体的可变重链 结构域的氨基酸序列的核酸，所述抗体特异性结合至抗原， c) 培养细胞，所述细胞包含b)中分离的核酸或其变体，其编码在一个或多个表达盒 内的轻和/或重链可变结构域的人源化版本， d) 从细胞或培养基回收抗体，和从而产生特异性结合至抗原的抗体。 在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤： a) 提供分泌抗体的（成熟的）B细胞的群体（获得自绵羊的血液）， b) 用至少一种荧光染料（在一个实施方案中用一至三种或两至三种荧光染料）染色 B细胞群体的细胞， c) 在单个容器（在一个实施方案中容器是多孔板的孔）中沉积染色的B细胞群体的 单一细胞或来自染色的B细胞群体的细胞合并物， d) 在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯（PMA)存在的情况下培养沉积的单个B细胞， e) 测定单个B细胞或B细胞合并物的培养中分泌的抗体的结合特异性， f) 通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定特异性结合抗体的可变轻和重链结构域的氨 基酸序列，和从而获得编码单克隆抗体可变轻和重链结构域的核酸， g)将编码单克隆抗体轻和重链可变结构域的核酸引入表达盒中用于表达抗体， h) 将所述核酸引入细胞中， i)培养所述细胞，且从所述细胞或细胞培养上清液回收所述抗体，和从而产生特异性 结合至抗原的抗体。 在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤： a) 提供分泌抗体的（成熟的）绵羊B细胞的群体， b) 用至少一种荧本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于培养绵羊B细胞的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下培养绵羊B细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：M里特，S图尔纳维蒂，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH