本发明专利技术公开了一种促红细胞生成素受体修饰电极，是在电极表面通过ZnO溶胶-凝胶固定有促红细胞生成素受体作为识别元件的玻碳电极，该修饰电极制备方法简单、性能稳定，4℃避光放置50天后响应电流值仍维持在初始值的77%左右；以该修饰电极为工作电极、铂电极为对电极、饱和甘汞电极为参比电极、含有2mmol/LK3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6]的磷酸盐缓冲液为测试底液组建电化学生物传感器，可以快速、特异、灵敏地检测促红细胞生成素（EPO）和/或重组人促红细胞生成素（rhEPO），线性范围为5pg/L~500ng/L，检出限低至0.5pg/L，特别是能根据峰电位对EPO和rhEPO进行精确甄别，不但适用于低浓度EPO或rhEPO的检测，而且适用于体育竞技中对兴奋剂rhEPO的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于电化学检测
，涉及一种修饰电极及其制备方法，还涉及以该修饰电极作为工作电极组建的电化学生物传感器及其检测方法。
技术介绍
促红细胞生成素(erythropoietin, ΕΡ0)是一种糖蛋白激素,在人体内主要是由肾脏生成的一种造血生长因子，其生理功能是促进骨髓红细胞的生成和释放。1985年人类首次利用基因工程技术合成了重组人促红细胞生成素(recombinant human erythopoietin,rhEPO)，由于其具有分裂原和分化原的双重功能，能在不输血的情况下产生输血效应，使病人避免病毒感染和输血过量的危险，已在肾性贫血的治疗方面发挥出重要作用。同时，因其具有提高机体携氧能力、增强运动耐力的特性，rhEPO在体育运动中成为新的兴奋剂。2005 年起，国际奥委会和世界反兴奋剂机构的禁用清单中，rhEPO被列为体育竞技中禁用的首个肽类物质。由于EPO与rhEPO具有完全相同的生物活性和基本一致的分子结构，唯一差别仅在于等电点不同，EPO的等电点为3. 7 4. 7，rhEPO的等电点为4. 4 5· 1，因此精确区分EPO与rhEPO具有诸多困难。长期以来，EPO与rhEPO的甄别检测大多采用质谱、等电聚焦、凝胶电泳等方法相结合，但这些检测方法存在实验分离时间长、检测效率低、特异性差等缺点，不能满足对EPO和rhEPO进行快速、精确甄别的要求。因此，研究一种特异性好、灵敏度高、能够快速、精确甄别EPO和rhEPO的检测方法及工具势在必行。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种修饰电极，目的之二在于提供一种所述修饰电极的制备方法，目的之三在于提供一种以该修饰电极作为工作电极组建的电化学生物传感器，目的之四在于提供一种利用所述电化学生物传感器检测EPO和/或rhEPO的方法，所述修饰电极制备简单、性能稳定，以其为工作电极组建的电化学生物传感器可以快速、特异、灵敏地检测EPO和/或rhEPO，特别是能对EPO和rhEPO进行快速、精确甄别。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案 I.促红细胞生成素受体(EPOR)修饰电极,所述修饰电极是在电极表面通过ZnO溶胶-凝胶固定有EPOR作为识别元件的玻碳电极。2. EPOR修饰电极的制备方法，包括以下步骤 a.玻碳电极的预处理将玻碳电极表面抛光，清洁，干燥，备用； b.ZnO溶胶-凝胶的制备将乙酸锌溶于无水乙醇中，再在超声波作用下加入氢氧化锂，制得ZnO溶胶-凝胶溶液，备用； c.EPOR的固定将EPOR溶液与步骤b制得的ZnO溶胶-凝胶溶液混匀，滴加至经步骤a预处理的玻碳电极表面，干燥成膜，洗涤，即制得EPOR修饰电极。优选的，所述步骤a是将玻碳电极依次用0. 3 μ m和0.05 μ m的三氧化二铝粉末抛光打磨，每次打磨后先用水洗净，再依次用硝酸、丙酮和水超声洗涤，空气中晾干。优选的，所述步骤b是将乙酸锌溶于无水乙醇中制成浓度为O. lmol/L的溶液，再在超声波作用下加入氢氧化锂至终浓度为O. 067mol/L,制得ZnO溶胶-凝胶贮备液，临用前用无水乙醇按体积比为2: f 1:3进行稀释，制得ZnO溶胶-凝胶溶液。更优选的，所述步骤b是将乙酸锌溶于无水乙醇中制成浓度为O. lmol/L的溶液，再在超声波作用下加入氢氧化锂至终浓度为O. 067mol/L,制得ZnO溶胶-凝胶贮备液，临用前用无水乙醇按体积比为1:2进行稀释，制得ZnO溶胶-凝胶溶液。优选的，所述步骤c是将步骤b制得的ZnO溶胶-凝胶溶液与浓度为IOng/L^lOO μ g/L的EPOR溶液按照体积比为4: f I: I. 15混合均匀，再将混合液滴加在经步骤a预处理的玻碳电极表面，空气中干燥，用磷酸盐缓冲液充分洗涤，即制得EPOR修饰电极。 更优选的，所述步骤c是将步骤b制得的ZnO溶胶-凝胶溶液与浓度为I μ g/L的EPOR溶液按照体积比为I: I混合均匀，再将混合液滴加在经步骤a预处理的玻碳电极表面，空气中干燥，用磷酸盐缓冲液(PBS)充分洗涤，即制得EPOR修饰电极。3. EPO和rhEPO电化学生物传感器，包括工作电极、对电极、参比电极和测试底液，所述工作电极为前述EPOR修饰电极，对电极为钼电极，参比电极为饱和甘汞电极；所述测试底液为含有 2mmol/L K3和 2mmol/L K4(后续简写为 2mmol/LK3 -K4 )且 pH 为 6. 2 9. O 的磷酸盐缓冲液。优选的，所述测试底液为含有2mmol/L K3 且pH为7. 4的磷酸盐缓冲液。4.利用前述EPO和rhEPO电化学生物传感器检测EPO和/或rhEPO的方法，是将EPOR修饰电极与样品溶液共孵育20分钟以上，然后以EPOR修饰电极为工作电极、钼电极为对电极、饱和甘汞电极为参比电极、含有2mmol/L K3 -K4 且pH为6. 2^9. O的磷酸盐缓冲液为测试底液构建电化学生物传感器，采用循环伏安法进行扫描测定，电位扫描范围为-0. 3疒0. 7V，电位扫描速率为l(Tl00mv/s，根据电位0. Γθ. 17V处的峰电流和EPO标准曲线计算样品溶液中EPO的浓度，和/或根据电位0. 06 0. 09V处的峰电流和rhEPO标准曲线计算样品溶液中rhEPO的浓度。优选的，所述EPOR修饰电极与样品溶液的共孵育时间为20分钟，所述电位扫描速率为 50mv/s。本专利技术的有益效果在于本专利技术的EPOR修饰电极制备方法简单，性能稳定，4°C避光放置50天后的响应电流值仍然维持在初始值的77%左右，以其为工作电极构建的三电极体系电化学生物传感器可以快速、特异、灵敏地检测EPO和/或rhEPO，线性范围均为5pg/L 500ng/L，检出限均低至0. 5pg/L，特别是能根据峰电位对EPO和rhEPO进行快速、精确甄另O，不但适用于低浓度EPO或rhEPO的检测，而且适用于体育竞技中对兴奋剂rhEPO的检测。附图说明图I为ZnO溶胶-凝胶贮备液和无水乙醇的稀释比对EPOR修饰电极电流响应的影响。图2为ZnO溶胶-凝胶溶液与EPOR溶液的体积比对EPOR修饰电极电流响应的影响。图3为EPOR溶液浓度对EPOR修饰电极电流响应的影响。图4为测试底液的pH值对EPO和rhEPO电化学生物传感器电流响应的影响。图5为工作电极在样品溶液中的孵育时间对EPO和rhEPO电化学生物传感器电流响应的影响。图6为循环伏安法扫描电位对EPO和rhEPO电化学生物传感器电流响应的影响。图7为以EPOR修饰电极为工作电极构建的电化学生物传感器的电化学响应及传感器特异性实验结果。其中a为单纯ZnO溶胶-凝胶修饰电极在PBS溶液中的循环伏安曲 线；b为裸玻碳电极在含有2mmol/L K3 的PBS溶液中的循环伏安曲线；c为单纯ZnO溶胶-凝胶修饰电极在含有2mmol/L K3 -K4 的PBS溶液中的循环伏安曲线；d SEPOR修饰电极在含有2mmol/L K3的PBS溶液中的循环伏安曲线；e为EPOR修饰电极在干扰物质溶液(500ng/L IgA、500ng/L IgG和500ng/L IgM)中孵育20分钟后的循环伏安曲线；f为EPOR修饰电极在500ng/L EPO标准品溶液中本文档来自技高网...
【技术保护点】
促红细胞生成素受体修饰电极，其特征在于，所述修饰电极是在电极表面通过ZnO溶胶？凝胶固定有促红细胞生成素受体作为识别元件的玻碳电极。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王云霞，张立群，府伟灵，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：
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