一种检测药物的单分子分析方法技术

一种检测药物的单分子分析方法，以天然α-溶血素构建药物纳米孔传感器，在电解池中依次加入靶标核酸样品和药物分子，记录并分析加入药物前后的纳米孔电流阻断信号变化，加入药物前，靶标核酸样品穿过纳米孔时可引起电流阻断信号；当核酸与药物结合后穿过纳米孔时，结合产物将引发特征性电流阻断信号，其阻断时间、阻断电流等参数与原核酸底物的信号相比均有显著差别，通过监测该特征性阻断信号的穿孔频率，建立穿孔频率与药物的浓度关系，可对目标药物进行定量分析，本发明专利技术实现药物分子的体外筛选和分析检测，具有简单、快速、高灵敏的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及纳米孔单分子分析技术和生物传感
，具体涉及一种检测药物的单分子分析方法。
技术介绍
在制药和医疗诊断领域中，通常要进行药物的浓度、含量的快速检测，如对药物制剂中有效成分含量的检测，对病人血清中药物浓度的检测等。核酸作为生物体中重要的结构和功能物质，目前是很多抗癌和抗病毒药物的靶标分子。药物检测的传统方法主要包括：色谱分析技术，如气相色谱法、高效液相色谱法；光谱分析技术，如紫外-可见分光光度法、红外分光光度法、荧光光谱法；电化学方法；表面等离子体共振(SPR)方法等。然而在实际样品分析中，这些方法通常需要复杂的样品前处理过程，用时长，成本高。此外，光谱方法大多灵敏度低，分析速度慢，且检测中受限于药物分子的光谱吸收性质，或需要荧光标记。而电化学方法和SPR方法大多需要在电极或芯片界面进行核酸探针的化学修饰，处理步骤较为繁琐。上述传统方法已难以满足药物筛选和疾病诊断的需求，亟需发展快速简便的高灵敏药物检测手段。纳米孔作为一种单分子分析技术，具备灵敏度高、无需标记、简单、廉价、快速等优势。检测过程中可连续直接读取信号，无需进行扩增、克隆和复杂的样品处理。天然α-溶血素蛋白纳米孔具有独特的单分子尺度，可以在单分子层次识别多种核酸结构。靶标核酸的小分子药物通常会引起核酸尺寸、结构的变化，这些变化容易被α-溶血素蛋白纳米孔所识别。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的是提供一种检测药物的单分子分析方法，实现药物分子的体外筛选和分析检测，具有简单、快速、高灵敏的优点。一种检测药物的单分子分析方法，包括以下步骤：a、纳米孔传感器的构建：基于天然α-溶血素构建纳米孔传感器，选择高分子绝缘材料制成样品池，样品池分为正池、反池，由高分子绝缘材料薄膜隔开，膜中心位置有一个直径为150微米小孔，在样品池两边分别加入摩尔浓度不大于1摩尔每升的电解质溶液，在直径150微米的小孔上构建磷脂双分子层，当加入天然α-溶血素蛋白，天然α-溶血素蛋白自发地插入磷脂双分子层中形成单个纳米孔，将两支银/氯化银电极插入正、反池的电解质溶液中，正池中的电极与电流检测系统相连，反池中的电极接地，在电极间施加不大于200mV电位后，记录通过纳米孔的电解质溶液单通道电流信号；b、药物的分析检测：在电解池反池中依次加入核酸样品和药物分子，分别记录加入药物分子前后的单通道电流信号的变化，核酸样品分子带有负电荷，在电势的驱动下穿过纳米孔，得到离子电流的阻断信号S；当加入药物后，药物与核酸分子发生特异性相互作用，药物与核酸的结合产物引发相应的离子电流阻断信号Sdrug，药物小分子因尺寸较小，在纳米孔传感器中难以检测出信号，因为药物特异性结合靶标核酸底物，该药物-核酸结合产物相比于靶标核酸分子，其尺寸、结构均发生变化，引起的Sdrug信号的阻断电流、阻断时间相比于S信号有显著不同，因此能够在单分子层次下判断药物分子是否结合核酸底物，当不同浓度的药物与10nM浓度的核酸底物特异性结合后，其产生的Sdrug信号的频率f会随药物浓度c变化，通过作f-c标准曲线，实现药物分子的高灵敏、高选择性定量分析。所述的高分子绝缘材料为聚四氟乙烯或聚苯乙烯。所述的电解质溶液为氯化钾、氯化钠或四甲基氯化铵缓冲溶液。所述的药物分子为有机小分子，包括与核酸(DNA、RNA)片段相互作用的天然药物和合成药物。所述的药物包括抗生素、抗病毒药、喹诺酮类抗菌药或抗肿瘤药。本专利技术的优点与积极效果：本专利技术提出的一种检测药物的单分子分析方法，不同于传统的药物检测方法，如高效液相色谱法等色谱分析法、紫外-可见分光光度法等光谱分析方法，其检测灵敏度更高，无需复杂的分离、提纯等样品前处理过程，无需荧光标记和界面化学修饰，简便、经济、快捷；本专利技术在检测中不受限于药物分子的光谱吸收性质，普适性强；本专利技术提出的检测方法可在复杂的生物样品中进行分析，不受其他生物大分子如蛋白、核酸等的影响，抗干扰能力强，选择性好。附图说明图1为实施例检测靶标核酸药物分子的纳米孔单分子分析示意图。图2为实施例加入PDS药物前后，纳米孔传感器对核酸的响应信号：a.加入PDS药物前，核酸的纳米孔穿孔电流信号，阻断时间、阻断电流统计柱状图；b.加入PDS药物后，药物-DNA结合产物的纳米孔穿孔电流信号，以及电流信号“阶段-1”和“阶段-2”各自的阻断时间、阻断电流统计柱状图。图3为实施例药物与核酸的结合产物的特征阻断信号(Sdrug)的频率与药物浓度的关系图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术做详细描述。以代表性核酸G-四联体靶标药物Pyridostatin(PDS)为实施例，来说明药物与核酸相互作用的单分子分析检测过程。PDS是一种人工合成的有机药物分子，结构式如图1所示。相关研究发现，PDS具备抗癌特性。细胞中端粒DNA序列含有重复单元(TTAGGG)n，可形成大量G-四联体结构。PDS药物对DNA的G-四联体具有较高的选择性和结合能力，可以很好地稳定癌细胞端粒中的G-四联体结构，抑制癌细胞内端粒酶对端粒的延长作用，从而引发癌细胞的凋亡，达到抗癌目的。本专利技术中涉及的检测仪器为高灵敏电流检测器，包括电流放大器、低通滤波器等。实验中所使用的试剂材料等，无特殊说明，均可从商业途径获得。PDS药物与DNA相互作用单分子分析的原理见图1，其中DNA底物的序列为5’-A25TAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA25-3’，下划线为一段端粒DNA序列，含重复单元(TTAGGG)n，该DNA序列在过量钾离子存在下形成稳定的G-四联体结构。该序列两端各连接一段含25个A碱基的序列，为引导链，使DNA分子进入纳米孔的频率更高。因为天然α-溶血素最窄处的孔径仅为1.4nm，小于G-四联体结构的尺寸，因此该G-四联体核酸穿过纳米孔时，将解链为直链DNA。实施例，一种检测药物的单分子分析方法，包括以下步骤：a、纳米孔传感器的构建：基于天然α-溶血素构建纳米孔传感器，选择高分子绝缘材料聚苯乙烯制成的样品池，样品池分为正池、反池，由带直径150微米小孔的高分子绝缘材料薄膜隔开，在样品池两边分别加入电解质溶液，能够在直径150微米的小孔上构建磷脂双分子层，电解质溶液为含0.5M四甲基氯化铵(TMACl)，0.1MKCl，5mMTris的水溶液，pH为7.4，当加入天然α-溶血素蛋白，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测药物的单分子分析方法，其特征在于，包括以下步骤：a、纳米孔传感器的构建：基于天然α‑溶血素构建纳米孔传感器，选择高分子绝缘材料制成样品池，样品池分为正池、反池，由高分子绝缘材料薄膜隔开，膜中心位置有一个直径为150微米小孔，在样品池两边分别加入摩尔浓度不大于1摩尔每升的电解质溶液，能够在直径150微米的小孔上构建磷脂双分子层，当加入天然α‑溶血素蛋白，天然α‑溶血素蛋白自发地插入磷脂双分子层中形成单个纳米孔，将两支银/氯化银电极插入正、反池的电解质溶液中，正池中的电极与电流检测系统相连，反池中的电极接地，在电极间施加不大于200mV电位后，记录通过纳米孔的电解质溶液单通道电流信号；b、药物的分析检测：在电解池反池中依次加入核酸样品和药物分子，分别记录加入药物分子前后的单通道电流信号的变化，核酸样品分子带有负电荷，在电势的驱动下穿过纳米孔，得到离子电流的阻断信号S；当加入药物后，药物与核酸分子发生特异性相互作用，药物与核酸的结合产物引发相应的离子电流阻断信号Sdrug，药物小分子因尺寸较小，在纳米孔传感器中难以检测出信号，因为药物特异性结合靶标核酸底物，该药物‑核酸结合产物相比于靶标核酸分子，其尺寸、结构均发生变化，引起的Sdrug信号的阻断电流、阻断时间相比于S信号有显著不同，因此能够在单分子层次下判断药物分子是否结合核酸底物，当不同浓度的药物与10nM浓度的核酸底物特异性结合后，其产生的Sdrug信号的频率f会随药物浓度c变化，通过作f‑c标准曲线，实现药物分子的高灵敏、高选择性定量分析。...

【技术特征摘要】
1.一种检测药物的单分子分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、纳米孔传感器的构建：
基于天然α-溶血素构建纳米孔传感器，选择高分子绝缘材料制成样品池，
样品池分为正池、反池，由高分子绝缘材料薄膜隔开，膜中心位置有一个直径为
150微米小孔，在样品池两边分别加入摩尔浓度不大于1摩尔每升的电解质溶液，
能够在直径150微米的小孔上构建磷脂双分子层，当加入天然α-溶血素蛋白，天
然α-溶血素蛋白自发地插入磷脂双分子层中形成单个纳米孔，将两支银/氯化银
电极插入正、反池的电解质溶液中，正池中的电极与电流检测系统相连，反池中
的电极接地，在电极间施加不大于200mV电位后，记录通过纳米孔的电解质溶
液单通道电流信号；
b、药物的分析检测：
在电解池反池中依次加入核酸样品和药物分子，分别记录加入药物分子前后
的单通道电流信号的变化，核酸样品分子带有负电荷，在电势的驱动下穿过纳米
孔，得到离子电流的阻断信号S；当加入药物后，药物与核酸分子发生特异性相
互作用，药物与核酸的结合产物引发相应的离子电流阻断信号Sdrug，药物小分子
因尺寸较小，在纳米...

【专利技术属性】
技术研发人员：李景虹，张凌，刘广超，刘洋，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11