一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测80nmAuNPs的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测80nmAuNPs的方法，采用酶联免疫分析技术中的间接竞争酶联免疫法，利用抗原抗体的特异性结合定量地检测了80nmAu粒子。与现有技术相比，本发明专利技术通过修饰剂的作用，将半抗原成功地合成为全抗原，为抗体得以产生作出了重大贡献。利用机体的免疫应答效应，成功的制备出特异性高的抗80nmAuNPs多克隆抗体，抗体的保质期较长，因此，可行性高；利用酶联免疫分析技术中的间接竞争酶联免疫法对80nmAuNPs进行了一种定量检测，该方法的发明专利技术为今后纳米材料的定量检测提供了一种可行性较高的方法。该方法操作简单，可行性高，灵敏度高，检出限低，可实现高通量检测。

【技术实现步骤摘要】
一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测80nmAuNPs的方法
本专利技术涉及纳米材料的定量检测，特别涉及一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测80nmAuNPs的方法。
技术介绍
社会的发展必然伴随着科技的进步，随着20世纪末纳米技术的问世，纳米材料是一门新兴的并正在迅速发展的材料科学。纳米材料是指颗粒尺寸在纳米量级(1nm～100nm)的超细材料，具有小尺寸效应、大的比表面积、量子尺寸效应以及宏观量子隧道效应。正是由于这些特殊的性质，纳米材料在生活生产中得到了越来越广泛的应用，例如，纳米材料在生物传感器、生物探针、药物载体、医学成像、防晒霜等中有着非常重要的应用。然而科技都是有两面性的，纳米材料在给人们的生活生产带来方便的同时，其安全性问题也成为了全球人们最关注也是最担心的问题。正面纳米生物效应将给疾病早期诊断和高效治疗带来新的机遇和新的方法；负面纳米生物效应称为纳米毒理学它研究纳米物质对人体健康生存环境和社会安全等的潜在负面影响。2003年，Nature、Science在一年内，先后4次发表编者文章，之后美国化学会以及欧洲许多学术杂志也纷纷发表文章，与各个领域的科学家们探讨纳米生物效应。有调查研究显示，纳米金对微生物，癌症细胞等具有一定的毒理作用，日常生活中通常接触纳米粒子的途径分为：呼吸系统，皮肤和胃肠道。由于纳米粒子较大的比表面积，同种材料不同尺寸的纳米材料的毒理也不尽相同，因此，对纳米材料的定量检测显得尤为重要。据已报道的文献，对纳米粒子的定性分析可以通过x射线光电子能谱，x射线衍射，扫描电子显微镜，投射电子显微镜，原子力显微镜等等。但对于纳米粒子的定量检测目前仍是个国际难题，已有的对纳米粒子的定量检测方法研究主要有:紫外分光光度法测纳米浆料、纳米镀液中纳米微粒的含量；利用电感耦合等离子质谱法以及薄层色谱与电感耦合等离子质谱法联用对纳米金进行定量检测。两类方法均有一定的局限性，第一类方法仅局限于对金属纳米粒子的测量，对于非金属纳米粒子的定量检测具有很大的局限性，且对金属纳米粒子进行测量时首先要将其配制成溶液，要找到特定能溶解待测纳米材料的溶质，其次还要对该溶质进行紫外分光光度法建立其波长与吸光度的关系，最后再通过对比法确定待测纳米材料的测定波长，方法较为复杂，操作也相对繁琐；第二类方法样品的预处理较为繁琐，操作复杂，费时，所用实验仪器也相对昂贵。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测80nmAuNPs的方法，利用了二抗放大了检测信号，提高了实验分析的灵敏度，即通过测量抗原——一抗——二抗复合物的光学性号达到定量检测的目的，方法快速、简单，可进行高通量测定。本专利技术提供的一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测80nmAuNPs的方法，包括以下步骤：a、80nmAuNPs的制备；b、80nmAuNPs包被抗原和免疫原的制备；c、80nmAuNPs抗体制备：将得到的80nmAuNPs免疫原注射到动物体内，得到80nmAuNPs抗体；d、利用纯化好的高特异性的80nmAu抗体和80nmAu包被抗原进行间接竞争酶联免疫分析法，通过建立标准曲线达到定量检测未知浓度的80nmAu的目的。步骤a中80nmAuNPs的制备方法为：将HAuCl4溶液与蒸馏水混合后，加热沸腾，再加入柠檬酸三钠，继续反应，冷却至室温，得到80nmAuNPs。进一步的，步骤a制备80nmAuNPs的制备方法具体为：取500μLHAuCl4溶液与99mL蒸馏水于三口烧瓶中，用集热式恒温加热磁力搅拌器加热至沸腾，过程需要15min～30min，向沸腾的溶液中快速加入柠檬酸三钠，反应液迅速变黑，然后变成了泥土色红，继续反应35min后，撤去加热装置，搅拌冷却至室温，收集4℃避光储存待用，此泥土红色溶液即为80nmAuNPs。进一步的，步骤a加入0.7mL1wt％柠檬酸三钠溶液；步骤a中HAuCl4溶液的制备方法为：取1gHAuCl4·4H2O粉末溶解于50mL超纯水中，制得16.5mg/mL的HAuCl4溶液；由于还原剂柠檬酸三钠的量对纳米金尺寸的影响至关重要，尺寸大小与柠檬酸三钠的量成反比，经探索得出最佳的柠檬酸三钠的量为0.7mL1wt％柠檬酸三钠。步骤a中因HAuCl4易潮解，所以需一次性将粉末状的HAuCl4配制成溶液密封保存，又由于HAuCl4极易腐蚀金属，所以在配制溶液过程中不应使用金属钥匙称量氯金酸，本实验中的配制方法为取1gHAuCl4粉末溶解于50mL超纯水中，密封4℃冰箱保存。由于80nmAuNPs为小分子物质，属于半抗原，而半抗原只具有免疫反应性而不具备免疫原性。为了让80nmAuNPs具有免疫原性，需将其表面进行修饰进而连接上大分子物质成为既有免疫原性又有免疫反应性的全抗原。步骤b中80nmAuNPs包被抗原和免疫原的制备为：取步骤a制备的80nmAuNPs溶液，浓度为0.048mg/mL，搅拌的状态下加入硫代乙醇酸TGA搅拌10min～25min后，优选的搅拌15min，继续加入羟基琥珀酰亚胺NHS和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDAC避光搅拌2h～5h，优选的搅拌3h，调节pH＝9～10，加入1wt％牛血清白蛋白BSA或1wt％鸡卵清白蛋白OVA冰袋避光搅拌3h～8h(优选5h)，即得相应的免疫原和包被抗原，将所得溶液置于透析袋中，蒸馏水透析8h～15h(优选12h)，收集4℃避光储存待用；进一步的，步骤b中，硫代乙醇酸TGA与羟基琥珀酰亚胺NHS、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDAC的体积用量比为2:1:2,80nmAuNPs、硫代乙醇酸TGA、牛血清白蛋白BSA或鸡卵清白蛋白OVA的体积用量比为400:1:10。由于大尺寸的纳米金容易团聚，因此，上述试剂的用量比是专利技术人探究得到的，多余或少于以上配比，均不能实现本专利技术。所述硫代乙醇酸TGA为调节活化剂，所述羟基琥珀酰亚胺NHS为偶联剂；调节pH所用的碱为NaOH；所述中硫代乙醇酸TGA的浓度为≧9.8％，由于其显酸性，实验过程中需用NaOH调pH至7.0，羟基琥珀酰亚胺NHS的浓度为0.09mol/L,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDAC浓度为0.05mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为10mg/mL,鸡卵清白蛋白OVA浓度为10mg/mL。由于大尺寸的纳米金容易团聚步骤c中80nmAuNPs抗体制备方法为：将免疫原与福氏佐剂以体积比1:1混溶,对动物进行多次免疫，制得80nmAuNPs抗体。进一步的，步骤c中，80nmAuNPs抗体制备方法具体为：将免疫原与福氏完全佐剂等体积比混合注射到动物内，采用背部皮下多点注射的方式，注射8～10个点，免疫注射量为每次1mL/只。首次免疫三周后，进行第一次加强免疫，将免疫原与福氏不完全佐剂等体积混合均匀再注射到动物内即可，注射量为每次1mL/只，此后每隔一周再进行一次加强免疫，总共免疫次数为7～8次，中间周采血测效价，直到抗体效价满足实验需求。佐剂：某些物质预先或与抗原同时注入体内，可以增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答，这样的辅助剂称为佐剂。佐剂分为福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂两种，福氏不完全佐剂的制备方法为：无水羊毛脂和液体石蜡按1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测80nmAuNPs的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：a、80nmAuNPs的制备；b、80nmAuNPs包被抗原和免疫原的制备；c、80nmAuNPs抗体制备：将得到的80nmAuNPs免疫原注射到动物体内，得到80nmAuNPs抗体；d、利用纯化好的高特异性的80nmAu抗体和80nmAu包被抗原进行间接竞争酶联免疫分析法，通过建立标准曲线达到定量检测未知浓度的80nmAu的目的。

【技术特征摘要】
1.一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测80nmAuNPs的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：a、80nmAuNPs的制备:取500µLHAuCl4溶液与99mL蒸馏水于三口烧瓶中，用集热式恒温加热磁力搅拌器加热至沸腾，过程需要15min～30min，向沸腾的溶液中快速加入柠檬酸三钠，反应液迅速变黑，然后变成了泥土色红，继续反应35min后，撤去加热装置，搅拌冷却至室温，收集4℃避光储存待用，此泥土红色溶液即为80nmAuNPs；步骤a加入0.7mL1wt%柠檬酸三钠溶液；步骤a中HAuCl4溶液的制备方法为：取1gHAuCl4•4H2O粉末溶解于50mL超纯水中，制得16.5mg/mL的HAuCl4溶液；b、80nmAuNPs包被抗原和免疫原的制备；c、80nmAuNPs抗体制备：将得到的80nmAuNPs免疫原注射到动物体内，得到80nmAuNPs抗体；d、利用纯化好的高特异性的80nmAuNPs抗体和80nmAuNPs包被抗原进行间接竞争酶联免疫分析法，通过建立标准曲线达到定量检测未知浓度的80nmAuNPs的目的；步骤b中80nmAuNPs包被抗原和免疫原的制备为：取步骤a制备的80nmAuNPs溶液，搅拌的状态下加入硫代乙醇酸TGA搅拌10-25min后，继续加入羟基琥珀酰亚胺NHS和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDAC避光搅拌2-5h，调节pH=9～10，加入1wt%牛血清白蛋白BSA或1wt%鸡卵清白蛋白OVA冰袋避光搅拌5h，即得相应得到了免疫原和包被抗原，将所得溶液置于透析袋中，蒸馏水透析8-15h，收集4℃避光储存待用；步骤b中，硫代乙醇酸TGA与羟基琥珀酰亚胺NHS、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDAC的体积用量比为2:1:2。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中80nmAuNPs、硫代乙醇酸TGA、牛血清白蛋白BSA或鸡卵清白蛋白OVA的体积用量比为400:1:10。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中80nmAuNPs抗体制备方...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明翠，张月，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34