一种快速检测全血红细胞十六烷一烯酸的方法技术

本发明专利技术提供一种快速检测全血红细胞十六烷一烯酸的方法，属于生物检测技术领域，包括如下步骤：A）全血样品的前处理；B）对所述样品检测液采用气相色谱-质谱仪进行检测。本发明专利技术提供的检测方法具有样品用量少，前处理简单，灵敏度高，特异性强，定性、定量功能强大，并且整个检测过程时间短、检测通量高等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测全血红细胞十六烷一烯酸的方法
本专利技术属于生物检测
，涉及一种快速检测全血红细胞十六烷一烯酸的方法。
技术介绍
在人体内，少量脂肪酸以游离形式存在，大部分以结合形式，如甘油三酯、磷脂、糖脂等存在。从营养学角度，脂肪酸可分为必需脂肪酸和非必需脂肪酸，非必需脂肪酸是指机体可以自行合成，不必依靠食物供应的脂肪酸；必需脂肪酸是指人体维持机体正常代谢不可缺少而自身又不能合成或合成速度慢，无法满足机体需要，必须通过食物供给的脂肪酸。必需脂肪酸可分为ω（Omega）-6系列脂肪酸和ω（Omega）-3系列脂肪酸。膳食中必需脂肪酸缺乏将导致皮肤病变、神经和视觉疑难症、心脏疾病等问题。由于红细胞膜上脂肪酸的组成能够反映人群的长期饮食结构，而不会受到短期内饮食的影响。因此，测定人全血红细胞脂肪酸，能够准确、客观的反映机体内不同脂肪酸的营养水平。国内外有关脂肪酸检测的相关报道盛多，涉及到食品、环境、医药卫生、临床应用等多个领域，检测方法包括气相色谱法（GC）、气相色谱-质谱法（GC-MS）和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），检测样本类型更是涉及食物、水质、药品、血液、组织等。但是，不同的应用领域及不同的样品类型，所涉及的样品处理与脂肪酸检测分析流程千差万别，因此不同领域以及不同样品类型的脂肪酸检测方法之间无可比性。目前，全血红细胞脂肪酸的检测主要有GC、GC-MS和LC-MS/MS三种。GC是目前红细胞脂肪酸检测的常用方法，但是此方法的检测器对未实现色谱分离的类似脂肪酸，无法实现准确定性分离和定量分析，因此无法对多种脂肪酸特异性、准确的定性和定量分析。LC-MS/MS方法前处理较为复杂，且分析结果重现性较差。而GC-MS方法由于同时具有气相的分离功能和质谱的特异性定性、定量功能，所以可以解决GC和LC-MS/MS的弊端，但是现有的GC-MS方法分析时间较长，检测通量较低。中国专利201210247480.2公开了一种气相色谱-质谱联用检测脂肪酸含量的方法，该方法针对的样品为动物组织，样品的前处理包括皂化步骤，还需要充氮气保护，样品的前处理复杂。因此，本领域技术人员迫切需要一种前处理简单、检测快速、方法灵敏度高、特异性强的适用于全血红细胞脂肪酸的检测方法。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种快速检测全血红细胞十六烷一烯酸的方法，该方法的样品用量少，前处理简单，灵敏度高，特异性强，定性、定量功能强大，并且整个检测过程时间短、检测通量高。本专利技术仅涉及全血样本红细胞十六烷一烯酸的检测。一种快速检测全血红细胞十六烷一烯酸的方法，包括如下步骤：A）全血样品的前处理：从全血样品中分离红细胞，加入内标溶液和盐酸-甲醇溶液进行衍生化反应，然后加入萃取剂萃取，取上清液并氮气吹干，残渣中加入复溶剂，混匀，得到样品检测液；B）对所述样品检测液采用气相色谱-质谱仪进行检测，气相色谱条件包括：色谱柱采用极性色谱柱，载气为氦气，不分流进样，线速度流量控制方式，载气流量为0.80~1.00mL/min，起始柱温60℃，先升温至180℃，然后升温至220℃，整个升温程序的梯度时间为8~15min；质谱条件为：采用电子轰击离子源，采用全扫描和选择离子扫描方式。采用上述技术方案，前处理简单，通过萃取-吹干-复溶的过程，有效去除了干扰物质，使红细胞中的十六烷一烯酸转化为挥发性较强、适用于气相色谱质谱仪检测的十六烷一烯酸甲酯产物；检测方法的灵敏度高，特异性强，定性、定量功能强大，准确性好，并且整个检测过程时间短、检测通量高。优选地，所述内标溶液选自十七烷酸。除十七烷酸，外本专利技术还可以选用十五烷酸或十九烷酸作为内标溶液。优选地，所述萃取剂选自正己烷，所述复溶剂选自正己烷。使用正己烷作为萃取剂，可以将各种脂肪酸的甲酯化产物萃取出来，萃取效率高且有效避免了其他物质的干扰。优选地，所述内标溶液与红细胞的体积比为1：(1~2)；所述红细胞、盐酸-甲醇溶液、萃取剂及复溶剂的体积比为1：(10~25)：(20~50)：(4~10)。优选地，所述红细胞、盐酸-甲醇溶液、萃取剂及复溶剂的体积比为1：20：40：8。优选地，所述极性色谱柱选自规格为20m*0.18mm*0.20μm的极性毛细管色谱柱。优选地，所述气相色谱条件还包括：进样体积为1µL，进样口温度为220~230℃，后运行温度为240~250℃，后运行时间为2min，吹扫流量为3.0~5.0mL/min，总流量为50.0~60.0mL/min，平均线速度为35.0~45.0cm/s。优选地，所述质谱条件还包括：接口温度为210~230℃；离子源温度为220~240℃；四极杆温度为140~160℃，溶剂延迟时间为3.0~4.0min，全扫描范围为m/z60.00~450.00。优选地，所述检测方法还包括如下步骤：检测结果的定性判断和/或定量计算。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的检测方法可以实现全血样品红细胞中十六烷一烯酸的定性和定量检测，具有前处理简单，有效去除了干扰物质，灵敏度高，特异性强，定性、定量功能强大，准确性好，并且整个检测过程时间短、检测通量高。本专利技术采用全扫描和选择离子扫描同时进行的扫描模式，能够得到样品的总离子流色谱图和选择离子色谱图，总离子流色谱图可以用于对化合物进行定性，用于检测过程中监测出峰时间处的化合物是否为目标化合物，以免出现其他干扰。此外，选择离子扫描对每个化合物的特征离子进行扫描，解决了单独使用气相色谱对脂肪酸进行定量不够准确的问题，进一步提高了检测准确度和方法的特异性。本专利技术所使用的极性色谱柱适合十六烷一烯酸的分离分析，色谱柱的高柱效以及低流失，大大降低了质谱检测时的背景干扰，最低检出限达到了0.01mg/L，检测灵敏度高。按本专利技术提供的检测方法，单个样品检测时间为12min，与现有传统方法相比，检测时间短，仪器检测通量高。附图说明图1十六烷一烯酸甲酯的标准曲线。图2全血红细胞样品中脂肪酸甲酯的总离子流色谱图。图3全血红细胞样品中十六烷一烯酸甲酯的选择离子色谱图。图4全血红细胞样品中十七烷酸甲酯的选择离子色谱图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明。实施例一全血样品的前处理将抗凝全血样本混匀，离心，弃除上层血浆、白细胞、血小板等；向剩余红细胞中加入等体积的生理盐水，混匀后离心，弃除上层的生理盐水；再向剩余的红细胞中加入等体积的生理盐水，混匀后即得到分离好的红细胞样品。取50μL红细胞样品，置于螺旋盖玻璃离心管中，加入十七烷酸作为内标溶液，加入1mL3mol/L的盐酸-甲醇溶液，混匀后置烘箱中，90℃避光反应3h，衍生化反应完毕后，冷却至室温，加入2mL正己烷萃取甲酯化反应产物，取上清液并进行氮气吹干，然后向残渣中加入正己烷作为复溶剂，混匀，得到样品检测液。其中，十七烷酸与红细胞样品的体积比为1：1；红细胞样品、盐酸-甲醇溶液、萃取剂及复溶剂的体积比为1：20：40：8。通过上述前处理，将红细胞中的脂肪酸转化为挥发性较强、适用于气相色谱-质谱仪检测的脂肪酸甲酯产物，并萃取分离出来，有效避免了其他物质对后续检测的干扰。实施例二全血红细胞脂肪酸的检测将样品检测液使用气相色谱-质谱仪进行检测。色谱条件包括：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测全血红细胞十六烷一烯酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：   A）全血样品的前处理：从全血样品中分离红细胞，加入内标溶液和盐酸‑甲醇溶液进行衍生化反应，然后加入萃取剂萃取，取上清液并氮气吹干，残渣中加入复溶剂，混匀，得到样品检测液；    B）对所述样品检测液采用气相色谱‑质谱仪进行检测，气相色谱条件包括：色谱柱采用极性色谱柱，载气为氦气，不分流进样，线速度流量控制方式，载气流量为0.80~1.00mL/min，起始柱温60℃，先升温至180℃，然后升温至220℃，整个升温程序的梯度时间为8~15min；质谱条件为：采用电子轰击离子源，采用全扫描和选择离子扫描方式。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测全血红细胞十六烷一烯酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：A)全血样品的前处理：从全血样品中分离红细胞，加入内标溶液和盐酸-甲醇溶液进行衍生化反应，然后加入萃取剂萃取，取上清液并氮气吹干，残渣中加入复溶剂，混匀，得到样品检测液；B)对所述样品检测液采用气相色谱-质谱仪进行检测，气相色谱条件包括：色谱柱采用极性色谱柱，载气为氦气，不分流进样，线速度流量控制方式，载气流量为0.80～1.00mL/min，起始柱温60℃，保持0.2min，先以40℃/min的升温速率升温至180℃，然后以10℃/min的升温速率升温至220℃，保持2.3min，整个升温程序的梯度时间为9.5min；质谱条件为：采用电子轰击离子源，采用全扫描和选择离子扫描方式；所述内标溶液选自十七烷酸；所述极性色谱柱选自规格为20m*0.18mm*0.20μm的极性毛细管色谱柱。2.根据权利要求1所述的快速检测全血红细胞十六烷一烯酸的方法，其特征在于：所述萃取剂选自正己烷，所述复溶剂选自正己烷。3.根据权利要求2所述的快速检测全血红细胞十六烷一烯酸的方法，其特征在于：所述内标溶液与红细胞的体积比为1：(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁耀铭，燕启江，胡朝晖，程雅婷，赵蓓蓓，汤郡，刘菲菲，
申请(专利权)人：广州金域医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44