假单胞菌属菌株及其筛选方法技术

本发明专利技术涉及一株与三叶草共生的、降解多氯联苯的菌株及其筛选方法。所述细菌为假单胞菌属菌株（Pseudomonas sp.），名为SYC01，该菌株于2015年5月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.10784。该菌株来源于三叶草根际共生的微生物，能够降解多氯联苯（polychlorinated biphenyls，PCBs）。而利用与三叶草共生的Pseudomonas sp.降解PCBs的应用尚未见报道。该发明专利技术的确立，将在与植物共生的条件下消减土壤中的PCBs、防止PCBs对环境及生物的危害的治理工作中，扮演积极角色。同时，本发明专利技术还提供了一种通过联苯为唯一碳源和能源，从非PCBs污染点的、三叶草根际的土壤中分离筛选SYC01菌株的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术特别涉及一种假单胞菌属菌株5A)SYC01及其筛选方法。
技术介绍
多氯联苯（polychlorinatedbiphenyls，PCBs)是在Fe3+催化剂催化下、以联苯为 母体的、人工合成的含氯有机物，因氯的取代位不同，理论上共有209个同系物。作为一种 理化性能稳定的化工产品，曾在欧洲、亚洲、北美洲等地的多个工业生产领域中广泛应用， 全球生产总量已超150万吨，并且许多已曝露于环境之中。 自然环境中的PCBs，呈现出多个侧面的特性。首先，由于氯原子的存在，PCBs具有 抗生物降解性，仅在土壤中的半衰期就长达几年甚至几十年。其次，随着"蒸馏效应"、"蛙跳 效应"等大气环流活动，PCBs被从生产使用地远距离地输送到了从南极到北极的全球各地， 例如在中国上海，居民生活区域的室内、室外灰尘和农田土壤等样品中，均已检出PCBs(1.0 ~1. 97X103ng?g\n.d. ~1. 96X103ng?g1 和n.d. ~261ng?g3，远距输送性使PCBs从 点源性污染转变为面源性污染，成为更难解决的环境问题。再次，PCBs具有在食物链中传 递、在高级生物体中富集的特性，在全球各类哺乳动物的乳汁中，PCBs的检出浓度亦达到了 6. 78 ~360ug^kg1，在高级生物体中的浓度更是相应环境浓度的几十万倍。最后，PCBs还 具有生物毒性，并随着氯原子数的增加而增大，微量的PCBs就可能对生物产生致癌、致畸 和致突变的作用，对人类的生命活动造成重大负面影响。因此，世界卫生组织全球环境监测 系统/食品污染监测和评估计划（GEMS/F00D)监控的7种PCBs中，有6种为四氯取代或以 上，并将海产品中之这7种PCBs的总和量限定为0? 5mg?kg1 (或0? 5ppm)。 为扼制及预防泄露PCBs对环境及生物的危害，消减PCBs在环境中的总量是从根 源上解决该问题的优先策略。土壤中的PCBs占到环境中总量的93. 1 %，土壤是PCBs的最 终的汇聚之地，因此消减土壤中的、尤其是面源污染的PCBs，成为PCBs总量减量化的关键。 最初的、并沿用至今的获取降解菌的方法，是PCBs污染点样品中菌株的筛选分离 法。迄今报道的PCBs降解菌株中，大多以这种主流的方法获得。然而，这些菌株在实际污 染土壤中的应用结果却不甚理想，解效率只是实验室悬浮细胞的1/50、实验室土壤模拟的 1/2。众多的研究表明，最主要的原因是这些从特殊地点获得菌株的生存模式特殊，与土著 微生物菌群之间产生了生存竞争，使得实际土壤中很难保持住PCBs有效降解所需的生物 量，成为了面源污染减量化的障碍。 微生物与植物的共生，是一种自然界现象。在植物根际土壤中，共生细菌因不与其 它微生物菌群生存竞争而能保持较高水平的生物量。从非PCBs污染点的、植物根际土壤中 筛选出降解PCBs的共生菌株，既能解决生物量的问题，也能解决生存竞争的问题。有基于 此，本文从非PCBs污染点的、三叶草的根际微生物中，分离筛选出的一株对PCBs有降解能 力的细菌SYC01，并发现其对PCB52 (邻位氯取代）和PCB77 (对位氯取代）的四氯联苯均有 静息降解能力，表明SYC01对不同类型氯取代位的高氯代PCBs均有良好的降解能力，具有 良好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一株假单胞菌属菌株（/kewt/omwassp. )SYC01，该菌 株能降解PCBs。 本专利技术的目的之二在于提供该菌株的筛选方法。 为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案： 一株假单胞菌菌株，该菌株的保藏号为CGMCCNo. 10784。 一种筛选上述的假单胞菌菌株的方法，其特征在于该方法的具体步骤为： a. 采集三叶草根际土壤，用无菌水打散，形成悬浊液，取该悬浊液于液体合成培养基 LSM中，28 °C、150rpm下培养5~7d，得到菌悬液，取该菌悬液于LSM培养基中，转代5次； 所述的三叶草根际土壤与无菌水的质量体积比为1g:1〇~12ml;所述的悬浊液与LSM培 养基的体积比为10ml:(100~120)ml;所述的菌悬液与LSM培养基的体积比为10ml: (100 ~120)ml; b. 将步骤a所得菌悬液涂布于固体合成培养基SSM中，30 °C静置培养4d，获得单菌 落，挑取单菌落在固体LB培养基SLB上划线纯化3次，获得纯菌种； c. 将步骤b中的纯菌种制成菌悬液，并涂布于SSM平板上，28 °C静置培养，得到假单 胞菌菌株。 -种根据权利要求1所述的假单胞菌菌株在降解多氯联苯中的应用。。 本专利技术的该菌株来源于三叶草根际共生的微生物，能够降解多氯联苯 (polychlorinatedbiphenyls，PCBs)。该专利技术的确立，将在与植物共生的条件下消减土壤 中的PCBs、防止PCBs对环境及生物的危害的治理工作中，扮演积极角色。 牛物材料保藏信息 本专利技术的假单胞菌菌株SYC01，已于2015年5月7日保藏在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学 院微生物研究所，邮编：100101。该菌株的保藏编号为：CGMCCNo. 10784。该菌株的分类命 名是假单胞菌Pseudomonassp，名称为SYC01。【附图说明】 图1为本专利技术的假单胞菌菌株静息细胞催化降解PCB52的动力学曲线。 图2为图解法表示的本专利技术的假单胞菌菌株静息细胞催化降解PCB52的动力学双 倒数曲线。【具体实施方式】 下述实验例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。 实施例1、培养基的制备 1)合成培养基： A溶液：56. 77g?L1K2HP04, 21. 94g?L1KH2P04,12 . 96g?L1 (NH4)2S04; B溶液：0? 3g?L1CaCl2 ?H20,19. 5g?L1MgS04, 5g?L1MnS04 ?H20,1g?L1 FeS04 ? 7H20 ; C溶液：0. 1g?L1酵母浸膏。 液体合成培养基（LSM) :77. 5mLA溶液+ 10mLB溶液+ 910mLC溶液+2g联 苯，pH7. 2〇 固体合成培养基（SSM) :77. 5mLA溶液+ 10mLB溶液+ 910mLC溶液+ 2g 联苯+ 15g琼脂，pH7. 2。 2)LB培养基： 液体LB培养基（LLB) :10g?L1蛋白胨，5g?L1酵母浸膏，10g?LWaCl，pH7. 2。 固体LB培养基（SLB) :1000mLLLB+ 15g琼脂，pH7. 2。 实施例2、菌株的获得 1) 筛选：采集未被PCBs污染过的三叶草根际土壤1g，用10mL无菌水打散，取1mL 悬浊液于100mLLSM中，28 °C、150rpm下培养5~7d;取1mL菌悬液于新的100mLLSM 中，转代5次； 2) 分离：吸取最后一次转代培养的菌悬液200ML并涂布于SSM中，30 °C静置培养4d，获得单菌落； 3) 纯化：挑取单菌落在SLB培养基上划线纯化3次，获得纯菌种； 4) 获得：将3)中的纯菌种制成菌悬液，并涂布于SSM平板上。28 °C静置培养，挑选其 中生长快且好的一株菌株，并命名为SYC01，并接于SL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株假单胞菌菌株，该菌株的保藏号为CGMCC No.10784。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡星，杜丽婷，余应新，牛莉莉，胡雪峰，刘建勇，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：上海;31