多肽AFP12在制备抗肿瘤药物中的应用制造技术

本发明专利技术提供了多肽AFP12在制备抗肿瘤药物中的应用。通过MTT实验检测AFP12在细胞水平对乳腺癌细胞的作用，其结果表明AFP12能够明显的抑制MCF-7乳腺癌细胞的生长，且有剂效关系。药效学实验结果表明，AFP12对人乳腺癌MCF-7荷瘤鼠肿瘤的生长具有抑制作用，且毒性较低。运用Western Blotting技术观察细胞凋亡信号通路中的关键蛋白表达，证实AFP12可以诱导肿瘤细胞的凋亡，以此来产生抗肿瘤作用。AFP12为将来多肽药物的开发奠定了基础，具有显著的社会和市场价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
，具体涉及多肽AFP12在制备抗肿瘤药物中的应 用。
技术介绍
恶性肿瘤是严重危害人们生命的常见病、多发病，而乳腺癌是女性排名第一的常 见恶性肿瘤。据世界卫生组织统计，全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升 趋势。目前我国乳腺癌的发病人数也逐年增多。乳腺癌死亡率随年龄升高而增长，据统计， 在我国35岁以上女性乳腺癌患者的死亡率呈上升趋势，在70-75岁左右达到最高。在乳腺 癌的治疗中，化学疗法是主要手段，同时也是最有效的一种方法。但是化疗所使用的药物对 人体正常细胞伤害极大，一些乳腺癌患者在长期接受化疗之后，身体免疫机能出现问题，且 肿瘤对化疗药物也出现一定程度的耐药性，反而对于治疗产生了负面影响。因此，高效低毒 的乳腺癌治疗药物的开发是国际抗肿瘤药物研制的热点。 新型抗肿瘤活性多肽具有高亲和力、强特异性、低毒副作用的特点，此外大多数还 具选择性靶向肿瘤细胞的性质，因而在临床应用上具有非常重要的开发价值，作为抗肿瘤 化合物具有较好的前景。 多肽药物多数源于内源性肽或其他天然肽，因此结构清楚，作用机制明确；与一般 小分子化学药物相比具有活性高、用药剂量小、毒副作用低、无代谢异化等特点；与蛋白质 类药物相比，较小的多肽免疫原性相对较小；与抗体相比，由于它们体积微小，因此它们更 容易渗透到组织中；可化学合成，产品纯度高，质量可控。
技术实现思路
本专利技术采用固相化学合成法了获得具有较高抗肿瘤活性的抗肿瘤多肽AFP12。 本专利技术多肽AFP12氨基酸序列的全序列为： Ala-Leu-Lys-Ala-Pro-Lys-Cys-Thr-Trp-Thr-Ser-Pro-Lys-Ile-Ser-Arg-Gly-P he。其分子量为1991. 39D，等电点为10.9。 本专利技术提供了多肽AFP12在制备抗肿瘤药物中的应用。 本专利技术还提供了多肽AFP12在制备治疗乳腺癌药物中的应用。 本专利技术还提供了多肽AFP12在制备治疗人乳腺癌MCF-7药物中的应用。 通过MTT实验检测AFP12在细胞水平对乳腺癌细胞的作用，其结果表明AFP12能 够明显的抑制MCF-7乳腺癌细胞的生长，且有剂效关系。药效学实验结果表明，AFP12对人 乳腺癌MCF-7荷瘤鼠肿瘤的生长具有抑制作用，且毒性较低。运用Western Blotting技术 观察细胞凋亡信号通路中的关键蛋白表达，证实AFP12可以诱导肿瘤细胞的凋亡，以此来 产生抗肿瘤作用。AFP12为将来多肽药物的开发奠定了基础，具有显著的社会和市场价值。【附图说明】 图1多肽AFP12对人乳腺癌MCF-7细胞的体外抑制活性。 图2多肽AFP12对人乳腺癌MCF-7荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用。 图3多肽AFP12对人乳腺癌MCF-7细胞荷瘤鼠抑瘤率的影响。 图4检测加入多肽AFP12后细胞凋亡相关信号因子变化的Western Blot图。【具体实施方式】 下面通过实例及附图对本专利技术作进一步详细描述，但本专利技术的实施方式不限于 此。 实施例1多肽AFP12的制备 缩略语说明：PIP(哌啶）；DMF(二甲基甲酰胺）；H0Bt(l-羟基苯并三唑）；DIC(N， N-二异丙基碳二亚胺）；TFA (三氟乙酸） 1.多肽树脂的合成 制备从C端开始。取王氏树脂于反应器中，加入20% PIP/DMF溶液去保护30min， 抽滤得到去Fmoc的树脂。将Fmoc-Phe和缩合剂HOBt用适量的DMF溶解，缓慢加入DIC溶 液于室温下反应30min，加入去Fmoc的树脂偶联反应，抽滤得到带一个保护氨基酸的树脂。 采用同样的方法依次接入保护氨基酸。最后用20% PIP/DMF溶液去Fmoc保护30min，抽滤 既得本专利技术多肽树脂。 2.多肽粗品的制备 取本专利技术多肽树脂，加入TFA的裂解试剂室温反应，目的是将多肽从树脂上脱下。 将反应混合物抽滤，树脂用TFA洗涤3次，合并滤液后用旋转蒸馏，尽可能除掉TFA，然后加 入冰乙醚，会有白色固体析出，冷冻干燥既得本专利技术多肽的粗品。 3.多肽粗品的纯化 采用高效液相色谱法进行纯化，用反相C18柱，流动相系统为0. 1 % TFA/ 水-0. 1 % TFA/乙腈溶液，色谱柱流速为25ml/min，紫外检测波长为280nm，采用梯度系统洗 脱，循环上样纯化，取多肽粗品溶液上样于色谱柱，洗脱收集主峰。所得溶液再采用如上高 效液相方法进行换盐，流动相系统为1 %醋酸/水-乙腈。采用梯度洗脱，循环上样方法，上 样于色谱柱，收集换盐主峰并分析纯度。将换盐主峰溶液减压浓缩，冷冻干燥后得到纯化的 多肽。 实施例2所述多肽抗肿瘤体外活性检测 药品与试剂： DMEM培养基（Gibco公司）；MTT (Sigma公司）；DMS0分析纯（南京化学试剂有限 公司）；胎牛血清（Gibco公司）；胰蛋白酶（生工）；抗体（Abeam公司）；细胞裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒（碧云天生物）。 细胞培养： 人乳腺癌MCF-7细胞株，购于武汉大学"中国典型培养物保藏中心（CCTCC) "。培 养条件：DMEM培养基（含10%胎牛血清、1%双抗）在37°C、5% 0)2条件下常规传代培养。 抗肿瘤活性分析采用MTT法，检测多肽AFP12对人乳腺癌MCF-7细胞的抑制活性。 收集对数生长期的MCF-7细胞，在96孔板铺适量细胞，当生长密度达到80 %左右 时，实验组加入用培养液稀释的不同浓度的AFP12溶液100 μ L。以加入AFP12多肽稀释液 的作为给药组，以不加任何药物的培养液作为对照组。每孔的终体积为100 μ L。5 % C02， 37°C孵育24h。然后加入MTT(5mg/mL)20 yL，置于细胞培养箱中继续培养4h。将上清吸除， 加入DMSO使蓝色结晶物充分溶解，酶标仪在490nm波长处测量各种的吸光度。 细胞生长抑制率按照公式：抑制率（％)= 1-给药组/对照组 实验结果如图1所示，多肽AFP12对人乳腺癌MCF-7有较好的抑制作用，并且抑制 作用随药物浓度增加呈现剂量依赖。在AFP12浓度为1、2、4、8、16、32 μ g/mL时，细胞抑制 率分别为15. 5 %、25. 4%、41. 7 %、47. 7 %、65. 4%、87. 4%，给药组与对照组比较，有统计学 差异（*P < 0· 01)。 实施例3多肽AFP12在动物体内的抗肿瘤活性实验 将已经接种人乳腺癌MCF-7的腹水型小鼠处死，无菌操作抽取腹水，用PBS缓冲液 稀释乳腺癌腹水细胞浓度为5 X IO6个/mL，以0. 2mL接种于雌性小鼠右侧腋窝皮下。密切 观察小鼠成瘤情况，待皮下有可触结节时随机分组并给药。使用测量瘤径的方法，每次测量 同时还需称量鼠重。给药方式均采用腹腔注射。对照组：等量的PBS缓冲液；5-氟尿嘧啶 组：10mg/kg，每天给药1次；多肽组：高中低剂量分别给药20mg/kg、10mg/kg和5mg/kg，每 天给药1次。连续给药10天。给药第十天后于次日处死小鼠 表1.多肽AFP12对人乳腺癌MCF-7荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用 实验结果如表1和图2和3所示，5-氟尿嘧啶组对人乳腺癌MCF-7小鼠移植瘤的抑 瘤率为77. 6% ;多肽高、中、低本文档来自技高网...

【技术保护点】
多肽AFP12在制备抗肿瘤药物中的应用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许激扬，卞筱泓，胡楠，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32