常温等温快速检测埃博拉病毒的方法、试剂及引物和探针，本发明专利技术涉及一种在常温等温条件下，对埃博拉病毒进行快速、实时、灵敏,准确检测的方法，通过特异性引物、特异性荧光探针、6种工程酶、其它化学组分的共同作用下，在具备荧光检测功能的仪器中实现核酸目标物的快速检测，并通过严格的实验操作步骤保证闭管检测，有效防止气溶胶污染；适合应用于多种荧光检测设备进行检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术是埃博拉病毒检测领域的一项新的技术与应用，涉及一种在常温等温条件 下，对埃博拉病毒进行快速、实时、特异性检测的方法，可在体外临床检测、食品安全、生物 安全以及农业领域具有广阔的应用前景。
技术介绍
埃博拉病毒（Ebolavirus，EB0V)可以引起一种急性出血性、动物源性传染病-- 埃博拉出血热（Ebolahemorrhagicfever，EHF)。该病毒首次于1976年在苏丹南部和刚 果民主共和国（旧称扎伊尔）的埃博拉河地区发现，因其引起病人全身性出血症状，故命名 为埃博拉出血热。EBOV属丝状病毒科，呈长丝状体，单股负链RNA病毒，外有包膜，纯病毒 粒子由一个螺旋形核糖核壳复合体构成，含负链线性RNA分子和4个毒粒结构蛋白。目前 已鉴定的EBOV有5个亚型：埃博拉-扎伊尔型（Ebola-Zaire，EB0V-Z)、埃博拉-苏丹型 (Ebola-Sudan，EBOV_S)、埃博拉-本迪布焦型 ?bola-Bundibugyo，EBOV_B)、埃博拉-莱斯 顿型（EbolaReston，EB0V-R)和埃博拉-科特迪瓦型（EbolaCoast，EB0V-C)。其中EBOV-Z 和EBOV-S对人类和非人类灵长类动物的致病性和致死率很高；EBOV-Z可高达90%的致死 率。因此，快速检测埃博拉病毒方法的建立具有重大意义。 埃博拉病毒是高度危险的病原体，必须在专门的实验设备中进行病毒的分离与鉴 定。在非洲疫区主要通过检测埃博拉病毒特异性IgM和IgG抗体以及检查病毒抗原或核酸 等进行诊断。但是病人血液中的病毒特异性IgM抗体在发病后2~9天出现，IgG抗体在 发病后6~18天出现，严重滞后了埃博拉病毒感染者的诊断，因而增加了对埃博拉病毒感 染者隔离和治疗的难度，同时也增加了埃博拉病毒的传染范围。对部分急性期血清中特异 性抗体滴度很低的患者，还需要同时进行病毒抗原或核酸的检测，不仅增加了诊断的时间 而且增加了诊断的成本。虽然，也出现了RT-PCR，套式RT-PCR以及RT-LAMP等诊断埃博拉 病毒的技术，但是这些技术对精密设备的高度依赖性，尤其是荧光定量PCR仪，使其主要集 中在中心实验室内使用，未能帮助医务人员真正在现场实现埃博拉病毒的快速检测。此外， 由于荧光定量PCR仪的高精密性，使得整个实验设置过程相对复杂，因此不但实验操作，而 且结果的解读也都需要受过专业训练的技术人员才能完成。这些缺点更让荧光定量PCR难 以在基层检测实验室或单位推广，因而资源匮乏的边远地区则更不便于使用。 分子生物学检测方法可以快速准确的进行病原体检测，可用于EBOV感染的早期 诊断，目前国内外已经建立了一些EBOV的检测方法。例如：IgM捕获和IgGELISAs技术， RT-PCR技术，套式RT-PCR技术，RT-LAMP技术等等。目前这些技术耗时较长，而且对埃博拉 病毒检测的灵敏度上有待进一步优化。 常温恒温核酸扩增技术利用荧光探针的高特异性结合重组酶介导链替换核酸扩 增技术（RAA核酸扩增技术）的快速、高灵敏度和高通量等特点，可以建立一种快速检测 EBOV的方法RAA核酸扩增技术是一种恒温核酸扩增技术。在37°C恒温下，来自于大肠杆 菌的recA重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜 索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，并 在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链。通常在30min内即能得到可以用琼脂糖凝 胶电泳检测到的扩增片段。目前国内外应用RAA核酸扩增技术建立了一些致病微生物的新 型检测方法，例如登革病毒、肠道沙门氏菌、结核分支杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等 等，该技术在埃博拉病毒检测方面尚未发现报道。因此本专利技术所提供的方法在埃博拉病毒检测领域具有一定的开拓性，可以为临床 埃博拉出血热病的快速诊断和监测奠定坚实的基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种更能满足现场核酸快速检测 埃博拉病毒的引物、探针、试剂和方法。 本专利技术的第一个目的是提供常温等温快速检测埃博拉病毒的引物和探针。 常温等温快速检测埃博拉病毒的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的序 列为：NP-3-F：CATATGATGAAGGATGAGCCTGTAGTTTTCAG；NP-3-R：CAGGATTGCCATGAATTTATTCCTGTGATTC； NP-Probe：TCCACCATGGCTCACTGAAAAAGAGGCCA(F)G(H)A(B)GATGAGAATAGATTTG- SpacerC3 ； 其中，F为荧光基团，H为四氢呋喃位点，B为粹灭基团，3'末端为SpacerC3修饰。 常温等温，是指在某一恒定温度下进行孵育，温度为20°C-42°C，接近常温，并且 是均一恒定的温度。 本专利技术的特异性引物，是针对埃博拉病毒的核蛋白（nuclearprotein，NP)基因设 计的寡核苷酸。有两条寡核苷酸组成一对引物，分别特异性识别一个核酸目标物的上下游 核苷酸序列；长度在30-35核苷酸（nt)之间，序列中无回文序列、连续单碱基重复序列和 内部二级结构区；引物Tm值不作为设计时主要考虑因素；最佳引物对需通过试验优化筛选 出，其扩增产物为单一条带，无非特异性扩增和明显的引物二聚体。 本专利技术的特异性荧光探针（如图1所示），是针对埃博拉病毒的NP基因设计的寡 核苷酸长链。寡核苷酸单链专一性识别埃博拉病毒的NP基因序列的某一区域，不与特异性 引物识别位点重叠，长度为46-52nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基； 共有四个修饰位点，距离5'端的30-35nt的中部位置标记一个dSpacer(四氢呋喃，THF)， 作为核酸外切酶的识别位点；THF位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个粹灭基团， 两个基团的间距为2-4nt;3'末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团、生物素、生物 素-TEG或C3-spacer，用于抑制聚合酶从该位点开始延伸；探针的Tm值不作为设计的主要 考虑因素；荧光基团的种类较多，例如 淬灭基团可选择BHQl或BHQ2,以最大限度地降低背景荧光噪音为原则。 本专利技术的第二个目的是提供用于常温等温快速检测埃博拉病毒的试剂。 常温等温快速检测埃博拉病毒的试剂，其特征在于，所述试剂包括聚乙二醇、 Tris、乙酸钾、三磷酸腺苷、磷酸肌酸二钠盐、脱氧核糖核苷三磷酸、蔗糖、甘油、重组酶、单 链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、辅助蛋白、反转录酶、核酸外切酶、权利要求1所述的引物及 探针。 进一步地，所述试剂为冻干粉，由以下方法制成：将试剂在-80°C条件下预冻3-4 小时，预冻结束后放入真空冷冻干燥机中进行干燥，先于-20~_45°C干燥2-10小时，最后 10-18°C干燥1-2小时。冷冻干燥处理，是一种将反应混合物在超低温条件下进行干燥处理 的过程，目的是便于反应混合物的存储和运输，减少在长途运输过程中酶活性降低的几率。 将反应混合物分装于反应管中，在-80°C条件下预冻3-4小时，预冻结束后放入真空冷冻干 燥机中进行干燥，其过程分为主干燥（-20~_45°C，2-10小时）和终末干本文档来自技高网...
【技术保护点】
常温等温快速检测埃博拉病毒的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的序列为：NP‑3‑F：CATATGATGAAGGATGAGCCTGTAGTTTTCAG；NP‑3‑R：CAGGATTGCCATGAATTTATTCCTGTGATTC；NP‑Probe：TCCACCATGGCTCACTGAAAAAGAGGCCA(F)G(H)A(B)GATGAGAATAGATTTG—Spacer C3；其中，F为荧光基团，H为四氢呋喃位点，B为粹灭基团，3’末端为Spacer C3修饰。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘国宪，曹伟，周国辉，程奇，
申请(专利权)人：浙江泰晶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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