本发明专利技术公开了一种干酪乳杆菌降解亚硝酸盐的电子供体蛋白及其制备方法和应用，具体步骤为：(1)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种培养后，制成种子液，并接种至诱导培养基A中，静止诱导培养，得诱导工作发酵剂；(2)将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，静止诱导培养，得含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白培养液；(3)将含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的培养液进行离心，清洗后离心，得菌体；(4)在菌体中加入提电子供体蛋白缓冲液，加入溶菌酶，混匀后破壁，破壁溶液经离心后的上清液为降解亚硝酸盐的电子供体粗蛋白液。粗蛋白液经纯化得到电子供体蛋白。所述电子供体蛋白与亚硝酸盐还原酶的混合液可快速高效降解亚硝酸盐。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制品领域，为一种干酪乳杆菌鼠李糖亚种Lactobacillus caseisubsp.rhamnosus 6013(简称为LCR 6013)中降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的制备方法。
技术介绍
亚硝酸盐是一种潜在的致癌物质，在蔬菜发酵过程中极易积累，给产品带来潜在的食品安全问题，且过量摄入亚硝酸盐可诱发高铁血红蛋白症，因此严格控制食品中亚硝酸盐的含量非常重要。许多研究表明亚硝酸盐是亚硝胺的前体物，亚硝胺是一种强致癌物，可以诱发消化系统中的多种癌变，如胃癌、肠癌和肝癌。鉴于食品可能存在超标亚硝酸盐污染，肉制品中含有亚硝酸盐的潜在食品安全问题，水产养殖水体亚硝酸盐超标导致潜在食品安全问题等一系列的问题，寻求有效控制或降解亚硝酸盐的方法势在必行，除了加入食用安全的微生物外，还可利用亚硝酸盐还原酶(Nitrite reductase，简称为NiR)进行亚硝酸盐的生物降解。但是NiR是一种氧化还原酶，反应过程中需要电子传递体的参与，而且受氧气的抑制。现在公认的反硝化过程分为4步，分别由不同的还原酶催化。其中NO2转变成NO由亚硝酸还原酶(NiRs)所催化，其催化反应为=NO2 +e +2Η+— Ν0+Η 20，是反硝化作用区别于其它硝酸盐代谢的标志性反应，在反硝化过程中扮演了重要角色。NiRs分布于细胞壁与细胞膜之间，根据其辅基的不同分为血红素Cd I型亚硝酸还原酶(cd 1-NiRs)和铜型亚硝酸还原酶(Cu-NiRs)两种类型，它们分别以血红素Cd I和Cu作为辅基，每种反硝化细菌具有两种不同形式NiRs中的一种。微生物降解亚硝酸盐是最常用的方法，主要有乳酸菌属和假单胞菌属。由于假单胞菌可能有毒性，不适合于食品中降亚硝酸盐，从食用安全的乳酸菌干酪乳杆菌中提取亚硝酸盐降解的电子供体蛋白未见报道。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的制备方法，通过层析分离制备纯化亚电子供体蛋白液。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现:—种干酪乳杆菌降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的制备方法，包括如下步骤:(I)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种的冻干粉置于MRS培养基中，于30°C?40°C静止培养18h?36h后，制成种子液；(2)以I %?10 %的体积百分比，将种子液接种至诱导培养基A中，于30°C?40°C静止诱导培养18h?24h，得诱导工作发酵剂；所述诱导培养基A配方为:含诱导剂NaNO2*度为5 μ g/mL?20 μ g/mL的MRS培养基；(3)以5%?15%的体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，于30°C?40°C静止诱导培养24h?36h，得含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白培养液；所述诱导培养基B配方为:含诱导剂NaNO2浓度为10 μ g/mL?50 μ g/mL的MRS培养基；(4)将含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的培养液进行离心，用生理盐水清洗2次后离心，得含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的菌体；(5)在步骤(4)的菌体中加入提电子供体蛋白缓冲液，使菌体浓度为150mg/mL?400mg/mL，加入溶菌酶，混匀后破壁Ih?3h，破壁溶液经离心后的上清液为降解亚硝酸盐的电子供体粗蛋白液。步骤(5)所述溶菌酶的浓度为10mg/mL?50mg/mL。步骤(5)所述电子供体蛋白缓冲液中含有胰蛋白酶抑制剂和二硫苏糖醇，其浓度分别为 2 μ g/mL ?10 μ g/mL 和 2.0 μ mol/mL ?20.0 μ mol/mL。所述的干酪乳杆菌鼠李糖亚种为Lactobacillus casei subsp.rhamnosus6013。步骤(5)所述电子供体粗蛋白液还经过如下分离纯化步骤:(I)将硫酸铵研成细粉，加入硫酸铵至饱和度为20-30%，缓慢添加并搅拌，于0-4°C冰箱放置2-4h、离心后，收集沉淀溶于HEPES缓冲液；(2)经硫酸铵沉淀后的电子供体粗蛋白液在50mM、pH7.8的HEPES缓冲液透析，每隔I小时换一次缓冲液，直到硫酸铵透析完全；(3)透析后的蛋白液再经过高流速离子型琼脂糖凝胶DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱和Sephadex G-100葡聚糖凝胶过滤层析中的一种或两种层析，制得降解亚硝酸盐的电子供体蛋白。所述离心条件为7000-9000r/min下离心10_20min。所述阴离子交换层析是将透析后的蛋白液上样量为20_40mL至阴离子交换层析柱上，先用无NaCl的HEPES缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含0.5-1.0M的NaCl的100-200mL的HEPES缓冲液进行线性洗脱，收集洗脱液，测定每个洗脱峰的蛋白液和已知NiR进行反应，确定电子供体蛋白所在的峰，并且合并所有电子供体蛋白液，并用聚乙二醇20000浓缩；将经过离子交换层析、透析、浓缩后的电子供体蛋白上样于经HEPES缓冲液预平衡好的SephadexG-100葡聚糖凝胶柱；用同一缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，制得纯的降解亚硝酸盐的电子供体蛋白液。所述阴离子交换层析HEPES缓冲液浓度为20mM?80mM，pH为7.0?8.6 ;本专利技术电子供体蛋白降解亚硝酸盐的应用:此电子供体蛋白与NiR按1/5?1/15比例混合，其中反应体系(总体积为ImL):亚硝酸盐还原酶为0.2mg/mL，亚硝酸盐浓度为100 μ g/mL,加入纯化后的电子供体蛋白，最后用pH7.4的50mM HEPES缓冲溶液使得反应体系为ImL于30°C下静置反应20h后，灭酶后测定反应体系中亚硝酸盐含量。从文献报道可知Cu-NiRs中的电子传递在催化过程中包括3个快速的氧化还原过程:(a) TlCu被外源电子供体还原；(b)分子内电子从TlCu向T2Cu转移；(c) NO2在T2Cu中心被还原。在反硝化细菌的周质空间发现一系列小型氧化还原蛋白作为潜在的电子供体传递给NiRs，它们包括细胞色素c (Cyt C)、假天青蛋白(Paz)和天青蛋白(Az)，而本文发现的电子供体蛋白非常可能是细胞色素C，在体外生物氧化过程中作为电子供体传递给NiRs使TlCu被还原。本专利技术所述的电子供体蛋白可以安全运用到食品中，为降解亚硝酸盐提供了一种新的食用安全的电子供体蛋白，为以后的组织缺氧的辅助治疗提供一种新方法。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点:(I)本专利技术中使用的干酪乳杆菌鼠李糖亚种Lactobacillus casei subsprhamnosus 6013的产电子供体蛋白所需的培养基来源广泛，生产成本低，具有良好的商业前景。(2)由于干酪乳杆菌鼠李糖亚种LCR 6013是食用安全的，因此从中制备电子供体蛋白也是食用安全的。(3)本专利技术所公开的方法可制备的降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的数量和性质稳定，不容易损失，为降解蔬菜发酵、肉制品和养殖水体等3个领域中亚硝酸盐提供了一种新方法。(4)所制备的电子供体蛋白与NiR—起作用于亚硝酸盐，可快速高效降解亚硝酸盐，降解亚硝酸盐的最适合浓度为100 μ g/mL。(5)所制备的电子供体蛋白与NiR—起作用的比例为1:5?1:15。【附图说明】图1为实施例1透析后的蛋白液用阴离子交换层析柱DEAE Sepharose Fast Flow分离后的电子供体蛋白质本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种干酪乳杆菌降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将干酪乳杆菌鼠李糖亚种的冻干粉置于MRS培养基中，于30℃～40℃静止培养18h～36h后，制成种子液；（2）以1%～10%的体积百分比，将种子液接种至诱导培养基A中，于30℃～40℃静止诱导培养18h～24h，得诱导工作发酵剂；所述诱导培养基A配方为：含诱导剂NaNO2浓度为5μg/mL～20μg/mL的MRS培养基；（3）以5%～15%的体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，于30℃～40℃静止诱导培养24h～36h，得含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白培养液；所述诱导培养基B配方为：含诱导剂NaNO2浓度为10μg/mL～50μg/mL的MRS培养基；（4）将含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的培养液进行离心，用生理盐水清洗后离心，得含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的菌体；（5）在步骤（4）的菌体中加入提电子供体蛋白缓冲液，使菌体浓度为150mg/mL～400mg/mL，加入溶菌酶，混匀后破壁1h～3h，破壁溶液经离心后的上清液为降解亚硝酸盐的电子供体粗蛋白液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘冬梅，陈浩，周劲松，陈舒然，张馨月，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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