一种诱导间充质干细胞定向分化的方法技术

本发明专利技术涉及一种诱导间充质干细胞定向分化的方法，其解决了现有纳米界面材料不能实现智能动态调节细胞分化功能的技术问题，其包括如下步骤：(1)间充质干细胞扩增培养；(2)诱导MSCs向成骨分化；(3)继续培养7天后MSCs成骨分化检测。本发明专利技术可用于诱导间充质干细胞定向分化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
的一种间充质干细胞诱导分化方法，具体涉及的是。
技术介绍
由炎症、肿瘤、外伤等原因等造成的骨组织缺损发生率较高，造成患者极大的生理和心理障碍。大范围的骨缺损不能自愈，但是传统的自体骨移植存在骨量有限、供骨区出血、疼痛、感染、感觉缺失等并发症等问题，异体骨移植存在有来源不足、传播疾病、潜在的免疫系统反应等问题。因此，基于人工支架材料的骨修复成为目前再生医学的研究热点。这一过程中，从仿生和组织修复需求的角度设计与构建具有“生物响应调控”功能的高活性修复材料，实现细胞功能的选择性调控，促进骨组织修复重建成为再生医学发展方向。间充质干细胞具有高度自我更新能力和多向分化潜能，是细胞移植和组织工程的种子细胞，具有广阔的应用前景。细胞通过粘着斑结构感受支架材料微环境特征，引发细胞骨架改建、细胞核内转录因子表达，从而实现细胞-材料的界面信号交流。在这一过程中，粘着斑具有纳米分级结构，细胞骨架一直以纳米/秒的速率进行振动，进行信号传递，因此如果人工支架材料能够仿生细胞的纳米结构与纳米形变尺度，有可能实现细胞行为的有效调控。尽管近年来围绕诱导干细胞分化已经发展了大量纳米界面材料，如science文献研究证实纳米结构可以显著调控细胞的粘附、增殖与分化行为，给支架材料的“生物响应调控”功能设计以启示，但是这些纳米界面材料尚不能实现智能动态调节细胞分化功能。
技术实现思路
本专利技术针对现有纳米界面材料不能实现智能动态调节细胞分化功能的技术问题，发展。为此，本专利技术提供一种导间充质干细胞定向分化的方法，其包括如下步骤:(I)间充质干细胞扩增培养:采用无成骨诱导因子的DMEM培养基，MSCs细胞复苏后培养，胰酶消化并传代；(2)诱导MSCs向成骨分化:取MSCs接种于纳米管表面，仍采用无成骨诱导因子的DMEM培养基，培养箱中进行培养，接种后接受电响应性纳米管可逆氧化/还原反应所提供的电化学信号；继续培养，MSCs成骨分化检测。优选地，步骤⑴中，MSCs细胞复苏后于6孔板中贴壁培养，每l-2d用0.25%胰酶(100ml PBS，0.25g胰酶)消化并传代。优选地，步骤(2)中，在接种一天后接受电响应性纳米管氧化态/还原态转化所提供的电化学信号3次。优选地，步骤(2)中，取3-6代MSCs接种于纳米管表面，采用无成骨诱导因子的DMEM培养基，置于37°C、饱和湿度、体积分数为5%的C02，培养箱中进行培养。本专利技术所使用的电响应性智能纳米界面为钛基聚卩比略(Polypyrrole, Ppy)纳米管，其制备方法详见:Jingwen Liao, Shuilin ffu, Zhaoyi Yin, Shishu Huang, ChengyunNing,Guoxin Tan,Paul K.Chu.Surface-Dependent Self-Assembly of ConductingPolypyrrole Nanotube Arrays in Template-Free Electrochemical Polymerizat1n.ACS App1.Mater.1nterfaces 2014,6，10946-10951)；该材料在0.5V/-0.80V的外加电压驱动下，表层Ppy发生可逆的氧化还原反应。该材料可以实现电响应性氧化态/还原态可逆转化。氧化态/还原态可逆转化过程伴随着纳米管的开放/关闭:氧化态纳米管呈开放状态，管口内径24±4nm，高度556±99nm，管间距222±36nm ;还原态纳米管呈关闭状态，高度550± 138nm，管间距221±48nm。该过程还伴随着纳米管表面亲水性能的变化:氧化态纳米管水接触角104.51±14.96°，还原态纳米管水接触角 44.40 ±10.32° ο本专利技术MSCs培养于纳米管表面一天后接受电响应性纳米管氧化态/还原态转化所提供的电化学信号3次，继续培养7天，MSCs成骨分化蛋白骨形态发生蛋白(bonemorphogenetic protein 2, BMP2)分泌量达到传统化学诱导组的68±7%、骨涎蛋白(bonesialoprotein, BSP)分泌量达到传统化学诱导组的78±4%;细胞机械信号转导因子Yes相关蛋白(Yes associated protein, YAP)活化率达到65±5%，成骨特异性转录因子Runt相关基因 2(Runt related transcript1n factor 2, RUNX2)活化率达到 39±6%。本专利技术具有以下技术效果:本专利技术通过电响应性智能纳米界面诱导间充质干细胞定向分化，解决现有纳米界面材料不能实现智能动态调节干细胞分化功能的问题；本专利技术所使用的电响应性智能纳米界面具有纳米级形貌，并通过电响应性可逆氧化/还原反应实现界面的纳米管口开关转化与亲水性转化，从而为细胞分化提供智能动态电化学调控信号；本专利技术中所使用的纳米管与MSCs具有良好的亲和性，可促进MSCs细胞增殖，促进其定向成骨分化；本专利技术在不加入任何生化诱导因子的条件下达到了直接诱导间充质干细胞定向分化的目的，安全性好、可控性强。下面结合附图对本专利技术进行进一步的说明。【附图说明】图1是实施例1-5所述电响应性智能纳米界面的扫描电子显微镜照片；图2是实施例1-5所述电响应性智能纳米界面可逆氧化还原反应的CV曲线示意图；图3是实施例1-5所述电响应性智能纳米界面可逆纳米管开关照片；图4是实施例1-5所述电响应性智能纳米界面可逆亲水性变化示意图；图5是实施例1-5所述电响应性智能纳米界面诱导间充质干细胞成骨分化的免疫组化染色激光共聚焦观察图；图6是实施例1-5所述电响应性智能纳米界面调控间充质干细胞机械转导因子YAP与成骨特异性转录因子RUNX2的免疫组化染色激光共聚焦观察图。【具体实施方式】实施例1(I)间充质干细胞扩增培养:采用无成骨诱导因子的DMEM培养基，MSCs细胞复苏后于6孔板中贴壁培养，每l-2d用0.25%胰酶消化并传代。(2)诱导MSCs向成骨分化:取3-6代MSCs接种于纳米管表面，仍采用无成骨诱导因子的DMEM培养基，置于37°C、饱和湿度、体积分数为5%的C02，培养箱中进行培养，在接种一天后接受O次电响应性可逆氧化/还原反应。(3)继续培养7天后MSCs成骨分化检测，包括观察分化细胞的形态，免疫荧光检测蛋白骨形态发生蛋白2、骨诞蛋白、Yes相关蛋白、Runt相关基因2。通过以上步骤所得的间充质干细胞BMP2分泌量为传统化学诱导组的21±4%、BSP分泌量为传统化学诱导组的30±2% ;细胞机械信号转导因子Yes相关蛋白与Runt相关基因2活化率〈I%。实施例2步骤(2)中在接种一天后接受I次电响应性可逆氧化/还原反应，其它与实施例1相同。通过以上步骤所得的间充质干细胞BMP2分泌量达到传统化学诱导组的29±1%、BSP分泌量达到传统化学诱导组的38±6%以上；细胞机械信号转导因子Yes相关蛋白活化率达到18±1%，Runt相关基因2活化率达至IJ 12±1%。实施例3步骤(2)中在接种一天后接受2次电响应性可逆氧化/还原反应，其它与实施例1相同。通过以上步骤所得的间充质干细胞BMP2分泌量为传统化学诱导组的62±9%、BSP分泌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导间充质干细胞定向分化的方法，其特征是包括如下步骤：(1)间充质干细胞扩增培养：采用无成骨诱导因子的DMEM培养基，MSCs细胞复苏后培养，胰酶消化并传代；(2)诱导MSCs向成骨分化：取MSCs接种于纳米管表面，仍采用无成骨诱导因子的DMEM培养基，培养箱中进行培养，接种后接受电响应性可逆氧化/还原反应；(3)继续培养，MSCs成骨分化检测。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：卫彦，邓旭亮，宁成云，王树涛，谭帼馨，李瑛颖，张学慧，
申请(专利权)人：北京大学口腔医院，中国科学院理化技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11