从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法技术

一种从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法，其包括脐带处理、从脐带和脐血管中分离细胞并进行原代细胞培养、细胞传代培养获得间充质干细胞及将间充质干细胞诱导分化为软骨细胞，其中，从脐带和脐血管中分离细胞中包括采用消化液对脐带和脐血管进行消化。本发明专利技术所提供的方法可从脐带中分离和培养间充质干细胞，并将获得的间充质干细胞进行进一步诱导转化，可以用于间充质干细胞的大规模生产，在再生困难的受损组织的治疗方面具有重大的意义。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】从脫带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的 方法
本专利技术设及间充质干细胞
，尤其设及一种从厮带分离和培养间充质干细 胞并向软骨细胞诱导分化的方法。 【
技术介绍
】 骨关节炎（Osteoarthritis, 0A)被称作"不死的癌症"，其是一种随年龄增长而发 生率上升的W关节软骨退变和关节周围骨质增生为病理特征的慢性进行性骨关节疾病，主 要侵害关节软骨、骨和滑膜组织，导致关节疼痛、崎形和功能障碍，是引起中老年人疼痛的 最常见原因，且该病有一定的致残率，严重影响了患者的生活质量。目前骨关节炎的治疗主 要包括：运动及生活指导、物理治疗、药物治疗（非酱体类抗炎药、氨基葡萄糖口服，局部注 射玻璃酸钢及激素等）、外科关节置换术等，在一定程度上改善了患者的生活质量，但仍没 有理想的治疗方法，迫切需要寻求新的治疗方法及技术。该病最终会导致关节软骨的损伤， 若能修复受损的软骨将会明显改善患者病情，因此，如何修复受损的软骨并保持其功能，是 骨关节炎的治疗目标。但是由于关节软骨细胞难W再生和修复，是制约骨关节炎治疗进一 步发展的瓶颈。 利用诱导干细胞分化为软骨细胞，是促使关节软骨细胞再生和修复的新的治疗方 法，该治疗方法是将体外培养的功能相关的干细胞种植于天然或人工合成的，具有良好生 物相容性，可降解和具有一定=维结构的聚合物支架上，从而形成了细胞支架复合物，再将 其移植入人体组织缺损部位，从而形成关节软骨，实现软骨的再生与修复。其中，间充质干 细胞（MesenchymalStemCells,MSCs)为常用的细胞之一。 迄今为止，骨髓是间充质干细胞的主要来源，但骨髓采集是一项侵入性技术，有时 需要穿刺数次进行采集，且手术时需进行全身麻醉，手术过程复杂且困难，因此给患者带来 严重的精神和身体负担。 厮带是胚胎形成过程中由滋养层细胞形成的连接胚胎厮部与胎盘件的索状结构， 外覆羊膜，内含粘液性结缔组织。其中结缔组织内除油闭锁的卵黄囊和厮尿管外，还有一条 静脉和两条动脉。厮带是干细胞形成和经过的通道。因此，由厮带来源的间充质干细胞在适 当的条件下也具有自我更新能力，因此在不分化为特定细胞的时候可W进行扩大培养。和 来源于骨髓、肌肉和皮肤组织的间充质干细胞相比，厮带来源的间充质干细胞具有更为卓 越的分化能力。此外，与骨髓间充质干细胞相比厮带来源的间充质干细胞具有W下优势：厮 带资源丰富，对供者（母婴）无不良影响，对HLA(HumanLeukocyteAntigen,人类白细胞 抗原）配型相合的要求相对降低，可扩大供者范围等。 如专利CN103266081A中公开了从厮带中分离培养间充质干细胞的方法，其具体 公开了将厮带进行消化后采用间充质干细胞培养基进行培养，得到间充质干细胞的具体方 法，但是采用此方法获得的间充质干细胞的获得率较低。现有技术中间充质干细胞分离与 培养的成本高、间充质干细胞转化率低、操作复杂，无法实现间充质干细胞的大规模生产。 【
技术实现思路
】 为克服目前从厮带中分离培养间充质干细胞，并将间充质干细胞诱导分化为软骨 细胞过程成本高、转化率低的问题，本专利技术提供一种从厮带分离和培养间充质干细胞并向 软骨细胞诱导分化的方法。 本专利技术提供一种从厮带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法， 其包括厮带处理、从厮带和厮血管中分离细胞并进行原代细胞培养、细胞传代培养获得间 充质干细胞及将间充质干细胞诱导分化为软骨细胞； 从厮带和厮血管中分离细胞中包括采用消化液对厮带和厮血管进行消化，该消化 液为DMEM值U化eccominimumessentialmedium)培养基与F12培养基1:1混合后，再加 入0. 5-1. 5mg/ml胶原酶、4. 5-5. 5yg/ml透明质酸酶、lOOu/ml青霉素及100yg/ml链霉素 混合配置而成； 原代细胞培养中包括采用细胞培养液进行培养，该细胞培养液为DMEM培养基与 F12培养基l:l混合后，再加入100u/ml青霉素、100yg/ml链霉素及10%胎牛血清； 细胞传代培养获得间充质干细胞包括在原代细胞培养中待细胞长至70% -85% 融合时，滴管吸取去除原代培养的培养皿中的细胞培养液，采用PBS洗漆后，再加入5-lOml 的0. 25%膜蛋白酶-EDTA溶液进行消化，于37°C下消化并观察细胞，待细胞胞体趋于变圆 时，立即加入等量的细胞培养液终止消化；用吸管轻轻吹打细胞，直至贴壁细胞悬浮，离屯、 获得所需细胞；用细胞培养液制成单细胞悬液，原代细胞按1:2进行传代培养获得第1代传 代细胞；使用同样的方法重复进行第2代及第3代传代细胞的培养； 将间充质干细胞诱导分化为软骨细胞包括将第3代（P3)细胞^7X10^ ml-lXl〇Vml接种至培养板中，培养板中预置消毒的盖玻片，培养2化后更换为含诱导因 子的诱导转化培养液，将培养板置于5%C〇2、饱和湿度80%、37°C培养箱中培养，每周换液 2-3 次； 其中，该诱导转化培养液包括；含5%胎牛血清的DMEM/F12培养液、Wng/ml转化 生长因子（TransformingGrowthFactor,TGF〇、0I、6_6. 5yg/ml膜岛素、98-100ymol/ ml地塞米松、0. 5-1. 5ymol/ml丙酬酸钢及6-6. 5yg/ml转铁蛋白。 优选地，在厮带处理过程中，采用双抗盐水冲洗厮带外表面，该双抗盐水为含 lOOu/ml青霉素和100yg/ml链霉素的生理盐水；厮带处理过程中包括去除厮带与厮血管 表面的凝血块，并更换容器，将表面处理干净的厮带置于双抗盐水中浸泡15-18min;取出 厮带，更换容器，再重复用双抗盐水浸泡2-4次，每次15-18min;更换无菌容器，厮带切段， 再次更换无菌容器，沿两侧纵向剖开厮带表面的羊膜，纵向撕开厮带，去除厮动脉和厮静脉 及其它血管渺血后，在双抗盐水中洗漆至盐水无色清澈。 优选地，从厮带和厮血管中分离细胞并进行原代细胞培养包括将已完成渺血处 理的厮带和厮血管分别转移至无菌消化容器中，用无菌剪刀将组织剪碎；然后将剪碎的组 织及PBS混合并离屯、获得沉淀物，将配好的消化液加入沉淀物中，吹起沉淀后转移至另一 无菌培养皿中，并放入无菌培养箱37°消化4-化；将消化好的溶液及组织离屯、后获得沉 淀物；沉淀物用细胞培养液重悬，接种于10cm培养皿中，此时的细胞称为原代细胞，置于 37°C、饱和湿度、含5%C〇2解箱中培养；2化全量换液，并每2-3天更换培养液。 优选地，上述消化液为DMEM培养基与F12培养基1:1混合后，再加入0. 5-lmg/ml 胶原酶、4. 5-5yg/ml透明质酸酶、lOOu/ml青霉素及100yg/ml链霉素混合配置而成。 优选地，细胞传代培养获得间充质干细胞还可在原代细胞培养中待细胞长至 70% -80%融合时，滴管吸取去除原代培养的培养皿中的细胞培养液，并采用PBS洗漆后， 再加入5ml的0. 25%膜蛋白酶-邸TA溶液进行消化；而第3代（P3)细胞还可W2X1〇5/ ml-1XlOVml接种至培养板后进行间充质干细胞诱导分化为软骨细胞的培养。[001引优选地，该消化液还可为DMEM培养基与F12培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法，其包括脐带处理、从脐带和脐血管中分离细胞并进行原代细胞培养、细胞传代培养获得间充质干细胞及将间充质干细胞诱导分化为软骨细胞，其特征在于：从脐带和脐血管中分离细胞中包括采用消化液对脐带和脐血管进行消化，该消化液为DMEM培养基与F12培养基1:1混合后，再加入0.5‑1.5mg/ml胶原酶、4.5‑5.5μg/ml透明质酸酶、100u/ml青霉素及100μg/ml链霉素混合配置而成；原代细胞培养中包括采用细胞培养液进行培养，该细胞培养液为DMEM培养基与F12培养基1:1混合后，再加入100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素及10％胎牛血清；细胞传代培养获得间充质干细胞包括在原代细胞培养中待细胞长至70％‑85％融合时，滴管吸取去除原代培养的培养皿中的细胞培养液，采用PBS洗涤后，再加入5‑10ml的0.25％胰蛋白酶‑EDTA溶液进行消化，于37℃下消化并观察细胞，待细胞胞体趋于变圆时，立即加入等量的细胞培养液终止消化；用吸管轻轻吹打细胞，直至贴壁细胞悬浮，离心获得所需细胞；用细胞培养液制成单细胞悬液，原代细胞按1:2进行传代培养获得第1代传代细胞；使用同样的方法重复进行第2代及第3代传代细胞的培养；将间充质干细胞诱导分化为软骨细胞包括将第3代细胞以7×104/ml‑1×107/ml接种至培养板中，培养板中预置消毒的盖玻片，培养24h后更换为含诱导因子的诱导转化培养液，将培养板置于5％CO2、饱和湿度80％、37℃培养箱中培养，每周换液2‑3次；其中，其该诱导转化培养液包括：含5％胎牛血清的DMEM/F12培养液、10ng/ml转化生长因子βⅠ、6‑6.5μg/ml胰岛素、98‑100μmol/ml地塞米松、0.5‑1.5μmol/ml丙酮酸钠及6‑6.5μg/ml转铁蛋白。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄慈波，
申请(专利权)人：深圳中基恒润投资有限公司，闫立，
类型：发明
国别省市：广东;44