本发明专利技术公开了一种卵黄高磷蛋白磷酸肽富集方法，属于提取纯化分离领域。本发明专利技术方法是以介孔/大孔二氧化钛(TiO2)为吸附材料富集卵黄高磷蛋白磷酸肽，此法得到的卵黄高磷蛋白磷酸肽的N/P为4.5。介孔/大孔TiO2不仅可以利用金属氧化物TiO2对磷酸基团的特异性亲和作用，而且介孔-大孔结构的高比表面积和良好的孔道结构提供了更多的活性结合位点。当富集条件为：pH为2.5-4，初始多肽浓度为12-20mg/mL，吸附时间为5-20min，此时得到的PPPs的纯度为4.3-4.8，对应的吸附量为42-53mg/mL。本发明专利技术的方法不仅操作简单，而且快速有效，有利于在工业化生产中应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于提取纯化分离领域。
技术介绍
蛋黄蛋白粉是蛋黄卵磷脂工业化生产的副产物，越来越来的学者对其进行了综合 研究并取得了一些进展。卵黄高磷蛋白（Phosvitin，PV)是脱脂蛋黄蛋白粉中的主要含磷 蛋白，一级结构中含有217个氨基酸残基，其中124个是丝氨酸残基，约占总氨基酸残基含 量的56%。已有众多研究表明，卵黄高磷蛋白可与Ca 2+，Mg2+，Mn2+，Co2+，Sr2+，Fe 2+，Fe3+等 结合。由于卵黄高磷蛋白与金属离子结合牢固，不易被水解，使得其生物学效价较低，不 利于营养吸收。现已证实，能与钙形成可溶性络合物的主要功能团是磷酸酰丝氨酸，所以 将磷酸酰丝氨酸残基含量高的卵黄高磷蛋白进行水解，其水解产物卵黄高磷蛋白磷酸肽 (Phosvitin Phosphopeptides，PPPs)可作为很好的钙吸收促进剂，不仅能增加 钙在小肠内 的吸收及其在体内的蓄积，而且卵黄高磷蛋白磷酸肽诱导的钙代谢无需维生素 D的参与， 且能促进铁、锌等离子的吸收。目前关于卵黄高磷蛋白磷酸肽研究仅限于实验室水平。常规的PPPs制备方法是 先从蛋黄粉中提取出卵黄高磷蛋白PV，然后对PV进行处理，纯化得到PPPs。也有报道，是 先对蛋黄粉进行脱脂，然后对脱脂后的蛋黄粉进行处理得到粗多肽，再纯化得到PPPs。采用 的纯化方法为乙醇钙沉淀法、膜分离法和离子交换树脂等方法。乙醇钙沉淀法虽然方法简 单，但是有机试剂用量大，对环境有一定的污染；膜分离法膜污染情况严重，需要进行清洗 维护；离子交换树脂法需要使用前和再生时进行处理，操作复杂。也有报道是磁纳米颗粒富 集法进行纯化的，但是磁纳米颗粒不仅稳定性差（重复使用三次时已不能发生吸附），而且 洗脱过程中使用的咪唑溶剂不符合食品领域的应用。
技术实现思路
为了克服目前卵黄高磷蛋白磷酸肽（Phosvitin Phosphopeptides，PPPs)，纯化过 程中存在的上述问题，本专利技术，直接以利用蛋黄卵磷脂 生产的副产物为原料，省去脱脂步骤，然后进行脱磷、酶解，制备粗多肽。本专利技术采用介孔/ 大孔 TiO2 (macro-mesoporous titanium dioxide，MMTD)为富集材料，直接将 PPPs 特异性 吸附出来，然后根据1102的性质进行洗脱（碱性条件下PPPs与TiO 2发生离子排斥反应）， 操作简便、节省时间，不仅提高了吸附效率，也大大减少了生产成本。 本专利技术提供了，所述方法是先将蛋黄蛋白粉进 行部分脱磷处理，然后使用胰蛋白酶对部分脱磷后的蛋黄蛋白粉进行酶解，得到粗多肽，再 采用介孔/大孔TiO 2M料对粗多肽进行吸附，洗脱，即得到卵黄高磷蛋白磷酸肽。 所述蛋黄蛋白粉，在本专利技术的一种实施方式中，是蛋黄卵磷脂生产中的副产物。 所述吸附、洗脱，在本专利技术的一种实施方式中，是将粗多肽配制成浓度为6mg/ mL-22mg/mL的溶液，按每30mL粗多肽溶液加入Ig介孔/大孔1102材料，在pH 1. 0-6. 0下 震荡吸附5-60min，然后过滤，洗涤滤渣以去除表面吸附的杂质，然后用碱性溶液将滤渣表 面富集的卵黄高磷蛋白磷酸肽进行洗脱。 所述粗多肽溶液，在本专利技术的一种实施方式中，粗多肽浓度为12mg/mL-20mg/mL。 所述pH，在本专利技术的一种实施方式中，pH 2. 5-4。 所述吸附，在本专利技术的一种实施方式中，吸附时间为5-30min，优选5-20min。 所述吸附，在本专利技术的一种实施方式中，是在15-25°C，150-220rpm进行。 所述洗脱，在本专利技术的一种实施方式中，是使用0. 05-0. 20m〇L/L的NaOH溶液。 所述吸附、洗脱，在本专利技术的一种实施方式中，条件是：pH为3.0,粗多肽浓度为 17mg/mL，吸附时间为20min。 所述部分脱磷处理，在本专利技术的一种实施方式中，是采用碱法脱磷。 所述部分脱磷处理，在本专利技术的一种实施方式中，是将蛋黄蛋白粉置于碱性溶液 中，搅拌处理，然后超滤除去磷酸根离子。在本专利技术的一种实施方式中，脱磷率为48-64%。 所述部分脱磷处理，在本专利技术的一种实施方式中，具体是：将蛋黄蛋白粉置于 0. 1-0. 2mol/L的NaOH溶液中，37°C条件下搅拌3h进行碱法脱磷处理，将处理后的溶液进行 超滤除去磷酸根离子（超滤膜为3000K，回流口压力为5~IOpsi，进口压力为20~30psi)。 所述酶解，在本专利技术的一种实施方式中，是将经脱磷处理的蛋黄蛋白粉（脱磷率 为48-64% )和水加入酶解反应器中，搅拌均匀，在37-50°C，pH 7. 0-9. 0条件下，加入胰蛋 白酶进行酶解；酶解结束后进行灭酶处理，得到含有PPPs的蛋黄蛋白水解多肽，即粗多肽； 所述底物蛋黄蛋白粉的浓度为〇. 5-2. 0%，酶：底物=1:20-1:200。在本专利技术的一种实施方 式，水解度为12%以上。 所述酶解，在本专利技术的一种实施方式中，时间为0. 4-4h。优选50-100min。 所述酶解，在本专利技术的一种实施方式中，是在50°C、pH 8的条件下进行，底物蛋黄 蛋白粉的浓度为1% (m/v)，酶与底物质量比为5:100。灭酶处理后，先调节pH至中性，再 冷冻干燥得粗多肽。 所述介孔/大孔TiO2，在本专利技术的一种实施方式中，是采用溶胶凝胶法得到的。 所述介孔/大孔TiO2，在本专利技术的一种实施方式中，是按照以下步骤制备得到的： 柠檬酸溶于乙醇中，搅拌，然后加入氨水溶液，继续搅拌，之后将钛酸四正丁酯在搅拌状态 下，逐滴加入上述溶液，搅拌，然后静置；然后依次用水和无水乙醇对沉淀进行清洗，将洗涤 后的材料干燥，最后将上述材料置于马弗炉中进行煅烧；其中每〇. 3g的柠檬酸，加入ISmL 质量浓度为25% -28%的氨水和5mL钛酸四正丁酯。 所述介孔/大孔TiO2，在本专利技术的一种实施方式中，是按照以下步骤制备得到的： 每〇. 3g的柠檬酸溶于乙醇中，搅拌30min，然后加入质量浓度为25% -28%氨水溶液18mL， 继续搅拌l〇min，之后将5mL钛酸四正丁酯在搅拌状态下，逐滴加入上述溶液，继续搅拌lh， 然后静置；然后依次用水和无水乙醇对沉淀进行清洗，将洗涤后的材料干燥，最后将上述材 料置于550°C煅烧4h。 所述溶解柠檬酸的乙醇，在本专利技术的一种实施方式中，为40mL 95%无水乙醇。 所述煅烧，在本专利技术的一种实施方式中，煅烧条件为550°C，4h。 本专利技术还要求保护按照上述方法得到的卵黄高磷蛋白磷酸肽，以及其在食品方面 的应用。 本专利技术的有益效果： (1)本专利技术提供的卵黄高磷蛋白磷酸肽的富集方法操作简单、分离纯化周期较短， 适合工业化应用；从吸附、清洗到洗脱整个过程在1~3小时内完成；而常规乙醇沉淀法 时间为2-3个小时，膜分离法时间为4个小时，且步骤繁多，膜容易污染；（2)本专利技术方法 所得卵黄高磷蛋白磷酸肽产品的N/P为4. 3-5. 0,与目前报道方法得到的磷酸肽相比，纯度 较高；（3)本专利技术方法还对现有的脱磷方法和酶解方法进行了改进，直接对蛋黄蛋白粉进 行碱法脱磷，脱磷率可达64%，酶解的水解度为15.67% ;同时采用具有规则的孔道结构与 较大的比表面积的介孔/大孔TiO2富集PPPs，吸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种卵黄高磷蛋白磷酸肽富集方法，其特征在于，所述方法是先将蛋黄蛋白粉进行部分脱磷处理，然后使用胰蛋白酶对部分脱磷后的蛋黄蛋白粉进行酶解，得到粗多肽；再采用介孔/大孔TiO2材料对粗多肽进行吸附，洗脱，即得到卵黄高磷蛋白磷酸肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨严俊，苏宇杰，李松娜，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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