一种酪蛋白磷酸肽(CPP)单体及其制备方法，其以牛乳中酪蛋白为原料，经过胰蛋白酶酶解、灭酶、精滤、醇沉、离心、过葡聚糖凝胶柱、中压柱层析、反相硅胶纯化、干燥等工艺制备持钙活性高、具有特定序列的酪蛋白磷酸肽CPP1、CPP2、CPP3，其分子量分别为1224.12、1082.14、1578.70，CPP1的序列为SIGpSpSpSEEpSAEVATEEV，属于αs2酪蛋白68-84的片段，CPP2的序列为IGpSEpSTEDQAMEDIK，属于αS1酪蛋白59-73的片段；CPP3序列为ELEELNVPGEIVEpSpSpSEESIT，属于β酪蛋白17-39的片段。本发明专利技术所得产品流动性好，25%酪蛋白磷酸肽的水溶液澄清透明，颜色为纯白色粉末；分子量小，有利于人体吸收；磷酸丝氨酸残基多，持钙活性高，能应用于以该特定序列的酪蛋白磷酸肽为活性成分的酪蛋白磷酸肽产品的质量控制。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物活性肽
，特别涉及一种以牛乳中酪蛋白为原料得到的酪蛋白磷酸肽(CPP)单体及其制备方法。
技术介绍
酪蛋白磷酸肽(CPP)是以牛乳酪蛋白为原料，通过生物技术制得，具有促进钙、铁、锌等二价金属离子吸收和利用的多肽，可用于各种营养、保健食品。酪蛋白磷酸肽是用胰酶或胰蛋白酶水解的多肽，经过精制、纯化制成，其核心结构为：-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-（Ser：丝氨酸，Glu：谷氨酸，P：磷酸基）。这一结构中的磷酸丝氨酸残基（-Ser(P)-）成簇存在，在肠道pH弱碱性环境下带负电荷，可阻止消化酶的进一步作用，使酪蛋白磷酸肽不会被进一步水解。酪蛋白磷酸肽能在小肠下端pH7～8环境下与钙结合而抑制磷酸钙沉淀的形成，使游离钙保持较高的浓度，促进钙的被动吸收，现已作为功能因子添加到保健品及乳品等食品中。中国专利公开的“一种制备酪蛋白磷酸肽的方法”（CN103114118A），采用在酪蛋白中加入蛋白酶进行酶解反应，利用超滤膜分离出酶解产物酪蛋白磷酸肽，产物酪蛋白磷酸肽经纳滤膜脱盐处理后获得。该方法操作简单，设备要求低，收率高，产品质量好，而且反应温度低，能实现产业化生产，但其采用单一蛋白酶酶解，酪蛋白磷酸肽得率和含量较低（最高产品含量为16%左右）、产品没有进行脱苦，并且没有指明特定的酪蛋白磷酸肽成分和结构，也没有验证最终得到的产品是否具有持钙活性。中国专利公开的“一种高纯度酪蛋白磷酸肽制备方法”（CN103571905A）涉及一种利用复合酶酶解乳源性酪蛋白为原料制备高纯度酪蛋白磷酸肽混合样品的方法（酪蛋白磷酸肽的得率≥17%，含量≥90%），主要经过酶解、分离、纯化、脱苦、膜过滤、干燥等工艺生产酪蛋白磷酸肽，但也未对持钙活性最高的酪蛋白磷酸肽成分进行分离及结构鉴定，不能规范化产品质量。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种制备具有特定序列的天然高活性酪蛋白磷酸肽CPP1、CPP2、CPP3，高效液相色谱面积归一法得纯度大于98%，其分子量分别为1224.12、1082.14、1578.70，CPP1的序列为SIGpSpSpSEEpSAEVATEEV，属于αs2酪蛋白68-84的片段（αs2(68-84)）；CPP2的序列为IGpSEpSTEDQAMEDIK，属于αS1酪蛋白59-73的片段（αs1(59-73)）；CPP3序列为ELEELNVPGEIVEpSpSpSEESIT，属于β酪蛋白17-39的片段（β(17-39)）。本专利技术所制备的高活性酪蛋白磷酸肽，持钙活性高，能有效地促进体内二价离子的吸收，具有巨大的实用价值和经济效益。本专利技术还提供了一种制备上述高活性酪蛋白磷酸肽的方法，该方法利用胰蛋白酶水解酪蛋白，利用调等电点、醇沉离心、反相硅胶纯化、干燥等工艺，得到酪蛋白磷酸肽的多肽单体。能应用于以酪蛋白磷酸肽为活性成分的酪蛋白磷酸肽产品的质量控制，也为酪蛋白酶解得到的酪蛋白磷酸肽产品提供质量控制依据。为解决上述问题，本专利技术所提供的酪蛋白磷酸肽单体的制备方法，包括以下步骤：（1）将酪蛋白加水溶解，再加入胰蛋白酶酶解，灭酶杀菌；（2）调节pH值4.0-5.0，过滤，将滤液调节pH值4.0-5.0，过0.2μm精滤进一再将精滤液调节pH值6.0-6.8，过纳滤膜，再过反渗透膜；（3）将步骤（2）所得浓缩液调节pH值5.0-6.0，温度5-10℃，再加入乙醇，调节乙醇浓度至40-60%，静置4-6h，离心或过滤，收集沉淀；（4）将步骤（3)所得沉淀用水溶解后过葡聚糖凝胶柱，收集洗脱液，冻干；粉末溶解过中压柱层析柱，收集洗脱峰，冻干；粉末用水溶解，调节pH至5.0-6.0，再加入乙醇，调节乙醇浓度至50%-70%，离心取沉淀；（5）将步骤（4）所得沉淀用制备高效液相色谱仪反相硅胶纯化，收集酪蛋白磷酸肽洗脱峰，真空浓缩，冷冻干燥，得到纯化的酪蛋白磷酸肽。（6）将步骤（5）所得纯化的酪蛋白磷酸肽用高效液相色谱仪进行反相硅胶纯化，收集酪蛋白磷酸肽洗脱峰，真空浓缩，冷冻干燥，得到酪蛋白磷酸肽单体。优化的是，步骤（1）中，溶解时料水重量比为1:4-6，溶解温度40℃-50℃。酶解条件为：加酶量为酪蛋白质量的0.1%-0.2%，反应温度40℃-50℃，反应时间1h-2h，pH7.0-9.0。进一步优化的是，步骤（1）中，酶解条件为：加酶量为酪蛋白质量的0.15%，反应温度45℃，反应时间1.5h，pH8.0。作为优化，步骤（3）中，浓缩液调节pH值5.5，温度8℃和乙醇浓度50%，静置5h。作为优化，步骤（5）中，所述反相硅胶纯化条件为：HPLC系统：LC-8A岛津制备高效液相色谱仪；色谱柱：HW－0121；色谱条件：流速：10mL/min；检测波长：215nm；进样量：1mL；流动相：A泵超纯水（含0.1%（v/v）TFA），B泵乙腈（含0.1%（v/v）TFA），B泵初始浓度为5%；洗脱方式：二元梯度洗脱；洗脱梯度：0.01min~25min，5%~18%；25.01min~85min，18~30%；85.01min~95min，30%~70%；95.01min~120min，70%~70%，120.01min~150min，70%~5%，重复进样，收集酪蛋白磷酸肽洗脱峰。作为优化，步骤（6）中，所述反相硅胶纯化条件为：HPLC系统：LC-15C岛津高效液相色谱仪；色谱柱：C18，Ultimate?AQ-C18，5μm，4.6×250mm；色谱条件：流速：1mL/min；检测波长：215nm；进样量：20μL；流动相：A泵超纯水（含0.1%（v/v）TFA），B泵乙腈（含0.1%（v/v）TFA），B泵初始浓度为5%；洗脱方式：二元梯度洗脱；洗脱梯度0~19.5min，5%~18%；19.5~55.5min，18%~30%；55.01min~65min，90%；65.01min~75min，5%，重复进样，收集酪蛋白磷酸肽洗脱峰。本专利技术在传统酪蛋白磷酸肽生产技术的基础上，以牛乳中酪蛋白为原料，经过胰蛋白酶酶解、灭酶、精滤、醇沉、离心、过葡聚糖凝胶柱、中压柱层析、反相硅胶纯化、干燥等工艺制备持钙活性高、具有特定序列的酪蛋白磷酸肽CPP1、CPP2、CPP3，通过HPLC-MS/ESI测得CPP1、CPP2、CPP3的分子量分别为1224.12、1082.14、1578.70，Edman反应测得三个活性肽的氨基酸序列，结果显示，CPP1的序列为SIGpSpSpSEEpSAEVATEEV，属于αs2酪蛋白68-84的片段（αs2(68-84)）；CPP2的序列为IGpSEpSTEDQAMEDIK，属于αS1酪蛋白59-73的片段（αs1(59-73)）；CPP3序列为ELEELNVPGEIVEpSpSpSEESIT，属于β酪蛋白17-39的片段（β(17-39)），能应用于以该特定序列的酪蛋白磷酸肽为活性成分的酪蛋白磷酸肽产品的质量控制。本专利技术所得产品流动性好，25%酪蛋白磷酸肽的水溶液澄清透本文档来自技高网...
【技术保护点】
酪蛋白磷酸肽CPP1、CPP2、CPP3，其分子量分别为1224.12、1082.14、1578.70，CPP1的序列为SIGpSpSpSEEpSAEVATEEV，属于αs2酪蛋白68‑84的片段；CPP2的序列为IGpSEpSTEDQAMEDIK，属于αS1酪蛋白59‑73的片段；CPP3序列为ELEELNVPGEIVEpSpSpSEESIT，属于β酪蛋白17‑39的片段。
【技术特征摘要】
1.酪蛋白磷酸肽CPP1、CPP2、CPP3，其分子量分别为1224.12、1082.14、1578.70，CPP1的序列为SIGpSpSpSEEpSAEVATEEV，属于αs2酪蛋白68-84的片段；CPP2的序列为IGpSEpSTEDQAMEDIK，属于αS1酪蛋白59-73的片段；CPP3序列为ELEELNVPGEIVEpSpSpSEESIT，属于β酪蛋白17-39的片段。
2.一种酪蛋白磷酸肽单体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将酪蛋白加水溶解，再加入胰蛋白酶酶解，灭酶杀菌；
（2）调节pH值4.0-5.0，过滤，将滤液调节pH值4.0-5.0，过0.2μm精滤进一再将精滤液调节pH值6.0-6.8，过纳滤膜，再过反渗透膜；
（3）将步骤（2）所得浓缩液调节pH值5.0-6.0，温度5-10℃，再加入乙醇，调节乙醇浓度至40-60%，静置4-6h，离心或过滤，收集沉淀；
（4）将步骤（3)所得沉淀用水溶解后过葡聚糖凝胶柱，收集洗脱液，冻干；粉末溶解过中压柱层析柱，收集洗脱峰，冻干；粉末用水溶解，调节pH至5.0-6.0，再加入乙醇，调节乙醇浓度至50%-70%，离心取沉淀；
(5)将步骤（4）所得沉淀用制备高效液相色谱仪反相硅胶纯化，收集酪蛋白磷酸肽洗脱峰，真空浓缩，冷冻干燥，得到纯化的酪蛋白磷酸肽；
（6）将步骤（5）所得纯化的酪蛋白磷酸肽用高效液相色谱仪进行反相硅胶纯化，收集酪蛋白磷酸肽洗脱峰，真空浓缩，冷冻干燥，得到酪蛋白磷酸肽单体。
3.根据权利要求2所述的酪蛋白磷酸肽单体的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，溶解时料水重量比为1:4-6，溶解温度40-50℃。
4.根据权利要求1所述的酪蛋白磷酸肽单体的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，酶解条件为：加酶量为酪蛋白质量的0.1%...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹庸，郭斌，王海波，李双祁，刘飞，吴成顺，黄慧明，彭维，
申请(专利权)人：广州绿萃生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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