可基因编码的全蛋白质索烃的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种可基因编码的全蛋白质索烃的制备方法，利用蛋白互锁结构单元使蛋白质单体分子之间发生相互缠绕，并利用类似于谍标签-谍捕手偶联反应对的蛋白质反应对使蛋白质单体分子发生环化形成索烃，首先构建包含所述蛋白质反应对和蛋白互锁结构单元的重组蛋白对应的编码基因并引入载体质粒中，然后在细胞中进行表达，纯化表达蛋白，得到蛋白质索烃。本发明专利技术利用基因编码的形式，在细胞体内较为高效地获得具有索烃结构的蛋白质，能够最大程度地降低蛋白质索烃制备的难度，获得功能稳定的活性蛋白质。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物高分子的制备，特别涉及蛋白质索烃在生物体内表达的制备方 法。
技术介绍
索烃是由环环相扣的分子构成的超分子，具有特殊的机械互锁结构，在超分子领 域中受到广泛关注。在超分子领域，一般制备索烃的方法主要有两种：一种是利用分子相 互缠绕并成环的可能性进行合成，这种基于统计学的方式往往收率低，可控性差；另一种是 利用非共价相互作用使分子预组装，能够以较高的收率获得目标产物（Gil-Ramir ez，G.; Leigh, D. A. ；Stephens, A. J. Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 6110-6150.) 〇 相比于超分子中的索烃，蛋白质索烃的特殊性质更集中在稳定性的提高上。蛋 白质结构及功能的稳定性对于其生物活性具有重要意义。特定的活性蛋白质，如一些酶， 往往对保存条件要求苛刻，并且对环境敏感性高，因而限制了其应用范围。通过改变蛋白 质的拓扑结构，如使蛋白质环化，或形成分子内二硫键等策略能够有效地提高蛋白质的 稳定性。研究指出，蛋白质的索烃化提高了有效浓度，从而极大地降低了正确折叠的自 由能，稳定了折叠结构。自然界中噬菌体HK97的衣壳蛋白便是具有多个索烃形成的"锁 子甲"结构，具有极高的热耐受性（Wikoff，W.R. ;Liljas，L. ;Duda，R.L.，et al.Science 2000, 289, 2129-2133.)。因此如果能够实现特定蛋白质的索烃化，就有可能实现提高底物 蛋白质对各种变性条件的耐受性，进而拓宽该底物的应用范围或降低应用门槛。 当前制备蛋白质索烃的报道极少，其中一个例子是利用肿瘤抑制因子p53结构单 元的二聚作为分子间互锁的单元，体外环境下的自然化学连接作为成环方式，成功制备了 多妝索经（Yan, L. Z. ;Dawson, P. E. Angew. Chem. Int. Ed. 2001，40, 3625-3627.)。然而目前 为止，并没有制备分子量较大的重组蛋白质索烃的报道。实现重组蛋白质的索烃化，以及在 细胞环境下的蛋白质索烃化，能够最大程度地降低制备的难度，同时有可能提高底物的适 应性。
技术实现思路
为了实现较为高效的蛋白质索烃化，本专利技术提供了一种重组蛋白质在生物体内 (包括原核细胞内和真核细胞内）表达并索烃化的方法。 要实现细胞内重组蛋白质的索烃化，重组蛋白质单体分子需要具备两个必要特 征：（1)单体分子之间能够相互缠绕，形成互锁结构单元；（2)单体分子形成分子内共价键 从而环化。对于第（1)个特征来说，已有报道，一些蛋白质结构域能够在细胞环境及体外环 境下形成相互缠绕的二聚结构，如肿瘤抑制因子P53、幽门螺旋杆菌中的蛋白质HP0242、DNA 结合蛋白Arc等，可以利用这些基元结构作为蛋白质链缠绕的二聚单元。同时，近年来，蛋 白质反应对一系列翻译后修饰酶以及特定蛋白质反应对的发展为第（2)个特征的实现提 供了思路，这包括转肽酶、谷氨酰胺转胺酶、谍标签-谍捕手偶联反应对等。其中值得一提 的是，谍标签-谍捕手是来源于化脓性链球菌的蛋白质反应对，具有极好的生物相容性，并 能耐受苛刻的反应环境，而且极为高效（2&1^1'；\0.;〇61丨1^3.，6丨31.?1'〇(3· Natl. Acad. Sci. USA2012, 109, E690-E697.)。谍标签为一段短肽链，谍捕手为一个 13kD 分 子量的结构域，谍标签与谍捕手之间首先发生超分子识别和结合作用，谍标签上的天冬氨 酸进而与谍捕手上的赖氨酸在自催化的作用下发生偶联反应形成酰胺键，从而实现相互之 间的稳定连接。该反应对已实现了弹性蛋白类似物以及特定功能蛋白质的环化（Zhang, W. Β· ;Sun，F. ;Tirrell，D. A.，et al. J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 13988-13997 ;Schoene，C.; Fierer，J. 0· ;Bennett，S. Ρ·，et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 6101-6104.)，本专利技术的 研究发现它们也能被应用于制备索烃。 具体的，本专利技术的技术方案是： -种蛋白质索烃的制备方法，包括以下步骤： 1)设计蛋白质索烃单体序列，该蛋白质索烃单体至少包括由两条肽链组成的蛋白 质反应对和位于该两条肽链之间的蛋白互锁结构单元，其中所述蛋白互锁结构单元使蛋白 质索烃单体发生分子之间的相互缠绕，所述蛋白质反应对使蛋白质索烃单体发生环化形成 索烃； 2)构建蛋白质索烃单体对应的编码基因并引入载体质粒中； 3)在细胞中表达步骤2)构建的基因； 4)对表达蛋白进行纯化，得到高纯度蛋白质索烃。 上述步骤1)中所述蛋白质反应对优选为谍标签-谍捕手反应对或其保持了偶联 反应性的突变体，它也可以是类似的其他基于重组自催化偶联原理的蛋白质反应对。 典型的谍标签的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No :1所示，其对应的基因序列可 以是序列表中SEQ ID No :2,基于密码子的简并性，也可以是其它编码同样氨基酸序列的基 因序列；相应的谍捕手的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No :3所示，其对应的基因序列可 以是序列表中SEQ ID No :4或编码同样氨基酸序列的其它基因序列。 所述谍标签和/或谍捕手的突变体是指在谍标签和/或谍捕手的氨基酸序列经过 1个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而衍生的肽链，所述取代、缺失或添加的氨基酸 残基不会对它们的偶联反应功能产生影响。对氨基酸残基进行取代、缺失或添加，以及对相 关功能的检测可以通过本领域的常规技术来实现。 除了谍标签-谍捕手工具对，所述蛋白质反应对还可以是转肽酶、谷氨酰胺转胺 酶等。转肽酶能够结合特定序列亮氨酸-脯氨酸-任意氨基酸-苏氨酸-甘氨酸，并切断 其中苏氨酸与甘氨酸之间的肽键，再催化苏氨酸与另一分子的多甘氨酸序列形成肽键，从 而实现共价相连。谷氨酰胺转氨酶可催化蛋白质之内或之间的酰基转移反应，实现蛋白质 之间的共价交联，也曾被用来实现多肽的环化（Touati，J. ;Angelini，A. ;Hinner，M.J.，et al. ChemBioChem2011, 12, 38-42.)。这些蛋白质工具可以使蛋白质索经单体表达后环化，形 成索烃环。步骤1)中所述蛋白互锁结构单元优选为肿瘤抑制因子P53、幽门螺旋杆菌中的 蛋白质HP0242、DNA结合蛋白Arc以及其他可导致链缠绕结构的蛋白质的寡聚化结构域，可 以利用这些结构的寡聚作为蛋白质链缠绕的单元结构。其中肿瘤抑制因子P53寡聚化结构 域的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No :5所示，其对应的基因序列可以是序列表中SEQ ID No :6,基于密码子的简并性，也可以是其它编码同样氨基酸序列的基因序列。 进一步的，除了蛋白质反应对和蛋白互锁结构单元，蛋白质索烃单体中还可以包 括一个或者多个相同或不同的功能蛋白结构域，这些功能蛋白结构域可以位于索烃环中 和/或索烃环外。所述功能蛋白可以是弹性蛋白类似物（ELP)、红色荧光蛋白（mCherry)、 β-内酰胺酶（BLA)、二氢叶酸还原酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质索烃的制备方法，包括以下步骤：1)设计蛋白质索烃单体序列，该蛋白质索烃单体至少包括由两条肽链组成的蛋白质反应对和位于该两条肽链之间的蛋白互锁结构单元，其中所述蛋白互锁结构单元使蛋白质索烃单体发生分子之间的相互缠绕，所述蛋白质反应对使蛋白质索烃单体发生环化形成索烃；2)构建蛋白质索烃单体对应的编码基因并引入载体质粒中；3)在细胞中表达步骤2)构建的基因；4)对表达蛋白进行纯化，得到蛋白质索烃。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张文彬，王晓威，刘栋，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11