灵芝多糖肽标准品及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种多糖肽标准品及其制备方法与应用。所说的多糖肽标准品以灵芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ　　ｌｕｃｉｄｕｍ）为原料母体提取液，将其浓缩，离心，透析而截留高分子量的多糖肽ＧＬ－ＰＰ，而后将高分子量多糖肽ＧＬ－ＰＰ进一步分离、纯化而得到。所述的灵芝多糖肽标准品可用于测定灵芝或灵芝孢子的产品多糖肽含量，从而提高灵芝产品的质量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种灵芝多糖肽标准品。同时，本专利技术还涉及一种灵芝多糖肽标准品的制备方法及其在灵芝或灵芝孢子制品中含量测定的应用。
技术介绍
现有技术普遍认为灵芝、灵芝孢子产品中多糖含量的测定以葡萄糖为标准品。其采用硫酸蒽酮溶液，紫外分光光度法测定，含灵芝多糖以无水葡萄糖(C6H12O6)计，而忽视有药用价值的多糖肽活性成分的含量。特别是灵芝精粉生产工艺过程中，往往在灵芝提取液中加入淀粉，或其它淀粉类辅料，使该法无法排除干扰，造成灵芝产品的多糖含量偏高的问题，从而影响了灵芝产品的质量提高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足之处，而提供一种可用于检测灵芝和灵芝孢子产品中多糖肽含量、从而可提高灵芝产品质量的灵芝多糖肽标准品。本专利技术的另一个目的在于提供一种制备灵芝多糖肽标准品的制备方法。本专利技术的目还在于提供一种灵芝多糖肽标准品在检查灵芝产品质量中的应用。本专利技术提供了一种灵芝多糖肽标准品，该灵芝多糖肽GL-PPT标准品由下述法制备获得首先是获得含有高分子量的多糖肽溶液(其制备的详细方法请参见申请人的另一份专利文件—申请号200410014681.3)其是以灵芝为原料进行水提取，将提取液浓缩离心，用无水乙醇沉淀，沉淀用水溶解，透析，截留(Gamoderma LucidumPolysaccharide Peptide简称GL-PP)。再通过进一步分离与纯化，而得到在毛细管电泳中呈多糖对称峰的灵芝多糖肽GL-PPT标准品，其具有下述的理化及生物性质1.形状浅褐色至褐色粉末状2.分子量相对分子质量(Mr)为20万～40万3.灵芝多糖与肽结合不分离，其结构中的单糖主要以β-型糖苷键连接，另有少数量以α-糖苷键连接4.多糖肽的糖链和肽链的连接性质为O-糖苷键连接。在温和条件下的稀碱水解，可以把与肽链上丝氨酸或苏氨酸的羟基相连的单糖或链水解下来。5.经毛细管电泳测多糖呈对称峰，因此说明该标准品是纯的(见图1)6.红外光谱(IR)红外光谱(IR)，通过400-4000cm-1扫描，GL-PPT组分分析表明，具有多糖吸收峰，分别为3385cm-1，2931cm-1，1647cm-1，1385cm-1和1074cm-1等多糖吸收峰，其中3385cm-1为强宽峰分子中羟基形成多种氢键所致的强吸收峰，在(891±7)cm-1处有吸收峰，这表明该糖肽具β-D葡萄糖苷键(见图2)。7.1H-核磁共振谱(1HNMR)多糖的信号多数在δ4.0-5.5ppm范围，β型的多糖小于5.0ppm。灵芝多糖肽δ4.21ppm处具有宽的异头碳信号，说明这是D-葡萄糖残基的构象(见图3)。8.13C-核磁共振谱(13C NMR)灵芝多糖肽化学位移103.8→70.2ppm，表明有β-(1→6)；103.8→86.7ppm，表明有β-(1→3)；103.8-80.1ppm，表明有β-(1→4)存在，β-(1→4)连接还有δ81.0处的信号；103-105ppm为甘露糖和杂多糖等单糖构型和构象(见图4)9.灵芝多糖肽中糖与肽连接性质在温和条件下，用稀碱水解，可以把与肽链上丝氨酸或苏氨酸的羟基相连的单糖或链水解下来，说明灵芝多糖肽中糖与肽为O-糖苷键连接。(见图5.1，5.2)一般认为灵芝主要活性成分为灵芝多糖，由于现有技术中还没有意识到灵芝多糖与肽牢固结合存在的现实。自然不可能把它作为检测与控制它的质量指标。本专利技术首先确定该化合物存在，提取该化合物做药理实验，证明它是活性成分后，又寻找应用这个化合物GL-PPT来鉴别与控制灵芝产品的质量方法，从而可提高被测产品的的质量。这种以多糖肽为标准品，在现有灵芝多糖的研究中未见记载。现有技术中从灵芝提取的多糖有白色和淡黄色，分子量有高有低之分，一般在近万到十几万范围内，而本专利技术所获得多糖肽，从颜色上从淡褐色至褐色，分子量都比现有的多糖高。本专利技术提供了一种制造灵芝多糖肽GL-PPT标准品的方法，该方法包括下述顺序的步骤(1)以灵芝为原料母体提取液，浓缩、离心、透析、截留而获得的含有高分子量多糖肽(GL-PP)，用浓度为1％的灵芝多糖肽GL-PP溶液，在不断搅拌中缓慢加入或无水乙醇、或甲醇、或丙酮至原体积的一半、静置过夜，用3000-4000r/min离心，得GL-PP-1沉淀，再用或无水乙醇、或丙酮、或乙醚、或者它们的混合物洗涤该沉淀，并冷藏干燥。(2)取步骤1所得的1％GL-PP-1溶液，3℃-5℃冷藏12个小时以上，次日对此溶液进行离心、弃去沉淀，取清液加2～4倍量无水乙醇或甲醇或丙酮沉淀，离心灵芝多糖肽，再用或无水乙醇、或丙酮、或乙醚、或者它们的混合物洗涤该沉淀，冷藏干燥，得GL-PP-2灵芝多糖肽。(3)取GL-PP-2，加1∶20水溶解，3℃-5℃冷藏12个小时以上，次日过DEAE-纤维素柱分离，分别用水，0.1mol/LNaCl和0.5mol/LNaCl及1mol/L NaCl先后洗脱，收集0.5mol/L NaCl洗脱部分，流水透析12～48h，蒸馏水透析4～12h，袋内液浓缩，冷冻干燥，得浅褐色至褐色粉末状物质为灵芝多糖肽GL-PPT标准品。在制造方法步骤2中的离心优选转速12000r/min离心10～40分钟。当需要进一步提高标准品GL-PPT的纯度时，可重复上述的第3步骤。本专利技术提供了一种灵芝多糖肽GL-PPT标准品在测定灵芝或灵芝孢子产品质量中的应用。本专利技术灵芝多糖肽GL-PPT标准品在测定灵芝药材活性成分-灵芝多糖肽中的应用，以灵芝多糖肽计，灵芝药材多糖肽不得少于0.15％。本专利技术灵芝多糖肽GL-PPT标准品在测定药准字《双灵固本散》中的应用，其质量应控制以灵芝多糖肽计，2g不得少于0.05g。附图说明图1为灵芝多糖肽的多糖毛细管电泳2为GL-PPT红外光谱3为GL-PPT1H核磁共振4为GL-PPT13C核磁共振5.1为稀碱水解前紫外光谱扫描5.2为稀碱水解后紫外光谱扫描6为灵芝多糖肽紫外光谱扫描7为灵芝多糖肽标准曲线图具体实施方式通过下面给出的本专利技术的具体实施例以及比较实施例可以进一步清楚地了解本专利技术。但它们不是对本专利技术的限定。实施例1(一)制造灵芝多糖肽GL-PPT标准品的方法1.将以灵芝为原料母体提取液，浓缩、离心、透析、截留而获得的含有高分子量的灵芝多糖肽。取浓度为1％的灵芝多糖肽GL-PP溶液，在不断搅拌中缓慢加入无水乙醇至原体积的一半、静置过夜，用4000r/min离心20分钟，得GL-PP-1沉淀，分别用乙醇、丙酮、乙醚洗涤该沉淀，并冷藏干燥。灵芝多糖肽(GL-PP)溶液是经由下述方法制备而成的(详细的请参见申请人的另一份中国专利申请2004100146813)1)、挑选段木或袋栽灵芝，将灵芝干品子实体清洁后，烘干，用粗颗粒粉碎机破碎成10-20目左右的烟丝状物质。2)、称取300克的已经粉碎的烟丝状灵芝，用95％的乙醇3000-4000毫升回流3小时，回收乙醇，干燥灵芝丝状物。采用灵芝丝状物∶热水＝1∶15的比例对灵芝丝状物进行热水回流提取3次，时间分别为2.5小时、2小时、1小时，合并过滤后的水提取液。3)、在60-90℃的温度下浓缩水提取液至原体积的十分之一，再用速度为3000-4000r/min，时间为15-30min的离心机进行离心分离，将上清液浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
灵芝多糖肽ＧＬ－ＰＰＴ标准品，其特征在于：以灵芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍ）为原料母体提取液，将其浓缩，离心，透析而截留高分子量的多糖肽ＧＬ－ＰＰ，而后将高分子量多糖肽ＧＬ－ＰＰ进一步分离、纯化而得到的灵芝多糖肽ＧＬ－ＰＰＴ标准 品，其具有下述的理化性质：（１）形状：浅褐色至褐色粉末状（２）分子量：相对分子质量（Ｍ↓［ｒ］）为２０万～４０万（３）灵芝多糖与肽结合不分离，其结构中的单糖主要以β－（１→３）（１→６）（１→４）聚糖肽，另有少量以α －糖苷键连接存在。（４）多糖肽的糖链和肽链连接性质为０－糖苷键连接。在温和条件下的稀碱水解，可以把与肽链上丝氨酸或苏氨酸的羟基相连的单糖或链水解下来。（５）灵芝多糖肽ＧＬ－ＰＰＴ标准品，其多糖在毛细管电泳（ＣＥ）中呈对称峰。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王赛贞，林志彬，刘梅英，李宝棣，林树钱，刘斌，曹琦珍，
申请(专利权)人：西安绿谷制药有限公司，福州绿谷生物药业技术研究所，王赛贞，林志彬，刘梅英，李宝棣，林树钱，刘斌，曹琦珍，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]