用于制备牛口蹄疫O型肽疫苗的多肽及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供一种用于制备牛口蹄疫O型肽疫苗的多肽，所述多肽包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列以及含有该多肽的肽疫苗。提供的牛口蹄疫O型合成肽疫苗具有良好的免疫效力，并且不会引发传统疫苗存在的发热、红肿等问题，因此本发明专利技术的疫苗可以有效应对目前口蹄疫病毒的抗原变异、不存在生物安全性，易于大规模合成，具有良好的应用前景。本发明专利技术还提供了所述多肽和肽疫苗的制备方法以及其制药用途。

【技术实现步骤摘要】
用于制备牛口蹄疫O型肽疫苗的多肽及其制备方法和用途
本专利技术属于医药
，具体而言，本专利技术涉及一种用于制备牛口蹄疫O型肽疫苗的多肽，以及含有这些多肽的疫苗及它们的制备方法。
技术介绍
口蹄疫(footandmouthdisease，简称FMD)是一种偶蹄动物发生的急性、高度接触性、发热性传染病，在世界范围内广泛分布。口蹄疫的传染性高，传播迅速，感染猪、牛、羊等牲畜后将导致幼畜死亡，成年动物生产能力急剧下降，因此严重危害畜牧业的发展和肉食及其畜产品的生产和供应。目前，口蹄疫使动物及动物产品的市场流通和国际贸易受到极大的封锁和限制，给流行国家和地区畜牧业生产造成巨大的经济损失。口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)感染引起的。口蹄疫病毒属于细小核糖核酸病毒，具有多型性、易变性等特点。目前，已知全世界有7种血清型的口蹄疫病毒：A、O、C、Sat1(南非I型)、Sat2(南非II型)、Sat3(南非III型)和AsiaI(亚洲I型)。这些主型中的每一种又分若干亚型，目前发现的亚型已有70多种。血清型A、O、C和AsiaI型的口蹄疫病毒最为常见，其中血清型A病毒的变种最多，具有超过30种亚型。研究结果表明，口蹄疫病毒的衣壳蛋白是由四种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4(LoganD等，1993年)组成的，每种各60个。VP1-VP3组成衣壳蛋白亚单位，位于衣壳蛋白的外侧，而VP4位于病毒颗粒的内部。VP1是主要的保护性抗原，现已发现O型口蹄疫有3个主要的抗原位点位于VP1上，其中133-160和200-213位构成了VP1上最重要且最容易变异的保护性抗原位点。口蹄疫病毒各型之间的抗原性不同，彼此之间不能交互免疫。而且，在同一种血清型中抗原差异的程度也很大，以至于能够有效地抵抗一种亚型的口蹄疫疫苗可能针对同一血清型中的另一种亚型没有保护性。此外，口蹄疫毒株的抗原性还在不断发生变化，随着时间的推移，原有疫苗的效力减弱甚至消失，因此给口蹄疫的防治工作带来了很大的困难。当前在我国牛群中流行的口蹄疫主要是O型、ASIAI型和A型口蹄疫。我国对口蹄疫实行强制性免疫，疫苗免疫是防治口蹄疫的主要手段。但是，我国现行使用的口蹄疫疫苗主要是病毒灭活疫苗，其存在着生物安全性差、副反应大、产品质量不稳定等问题。相比之下，目前世界上很多国家已经停止使用灭活疫苗，也禁止从使用灭活疫苗的国家进口畜产品。由此可见，在口蹄疫防治方面，我国已落后于世界发展形势。在口蹄疫新型疫苗的研究方面，先后有基因工程亚单位疫苗、口蹄疫病毒载体疫苗、口蹄疫基因工程修饰疫苗的研究报道，但是其在免疫效果、生物安全性方面都存在着诸多问题，影响了这些新型疫苗的使用。此外，这些疫苗对于当前已经发生变异的流行毒株往往效果较差，不能有效地保护动物。因此，本领域仍然存在对于安全、有效的口蹄疫新型疫苗的需求。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的在于提供一种用于制备牛口蹄疫O型合成肽疫苗的多肽，以及含有该多肽的疫苗。本专利技术的另一个目的是提供一种上述多肽以及疫苗的制备方法。本专利技术的又一个目的是提供上述多肽以及疫苗的用途。为实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种用于制备牛口蹄疫O型肽疫苗的多肽，所述多肽包含如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。此序列为口蹄疫O病毒的核心B细胞表位序列，负责产生针对口蹄疫病毒的中和抗体。SEQIDNO.1：YNGNCKYGENAVTNVRGDLQVLAQKAARCLPTSFNYGAIK本专利技术中提及的“多肽”和“合成肽”为同一概念，均是指通过固相有机合成得到的肽物质。优选地，所述多肽还包含具有增强免疫作用的口蹄疫内源或外源性T细胞表位氨基酸序列，其中，所述氨基酸序列选自SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4中的一个或多个。在本专利技术中，由计算机预测口蹄疫O病毒的T细胞表位，然后利用软件设计新的T细胞表位肽，再通过体外评价动物细胞免疫水平，由此筛选得到上述氨基酸序列的多肽，其能够辅助B细胞表位产生中和抗体。SEQIDNO.2：AGLAGVMVTESVAFRKKVSEQIDNO.3：VAQHNLSTEAIPLVVHESLMIVAQSIAGELKVSEQIDNO.4：SPGQVVYNRPHNSAYKV进一步优选地，所述多肽包含如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6或SEQIDNO.7所示的氨基酸序列。SEQIDNO.5：AGLAGVMVTESVAFRKKVYNGNCKYGENAVTNVRGDLQVLAQKAARCLPTSFNYGAIKSEQIDNO.6：VAQHNLSTEAIPLVVHESLMIVAQSIAGELKVYNGNCKYGENAVTNVRGDLQVLAQKAARCLPTSFNYGAIKSEQIDNO.7：SPGQVVYNRPHNSAYKVYNGNCKYGENAVTNVRGDLQVLAQKAARCLPTSFNYGAIK根据本专利技术的具体实施方式，本专利技术的多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6或SEQIDNO.7所示；优选地，所述多肽的氨基酸序列中的两个半胱氨酸的巯基可以经氧化连接在一起形成二硫键；进一步优选地，所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基之间可以反应形成共价连接。其中本文提供的序列是从N端到C端，也就是N端和C端的残基反应形成连接。具体而言，所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基的羧基与氨基、或者羧基与羟基之间反应形成共价连接。本专利技术提供的上述多肽可以直接向商业肽合成公司定制获得，或者采用可商购的自动合成仪、根据制造商的操作规程合成。另一方面，本专利技术还提供了上述多肽的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)以氨基树脂为起始原料，以由9-芴甲氧羰基保护的氨基酸为单体，按照所述氨基酸序列依次缩合接上氨基酸以合成所述多肽，每步缩合反应后用乙酰咪唑封闭未反应的氨基端；(2)合成完毕后加入裂解试剂，从而将所述多肽从氨基树脂上裂解下来；(3)使用乙醚沉淀所述多肽；和(4)对所述多肽进行超滤纯化，然后进行无菌处理。在上述制备方法中，所述步骤(1)具体包括以下步骤：(1-a)脱保护反应：将氨基树脂置于体积百分比为15-30％的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液中，在20-28℃条件下反应25-40分钟，从而脱除氨基树脂上的9-芴甲氧羰基保护基团；(1-b)洗涤：氮气吹干，然后用N-甲基吡咯烷酮洗涤氨基树脂；(1-c)缩合反应：加入1-羟基苯丙三唑(HOBT)、二环己基碳二亚胺(DCC)与由9-芴甲氧羰基保护的氨基酸，然后在20-28℃条件下反应0.5-2.5小时；(1-d)洗涤：氮气吹干，然后用N-甲基吡咯烷酮洗涤氨基树脂；和(1-e)封闭反应：加入重量体积百分比为1.5-4％的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液，在20-28℃条件下反应20-40分钟。在上述制备方法中，所述步骤(2)中裂解试剂的组分为体积比为85：8：6：1的三氟乙酸：三异丙基硅烷：苯酚：H2O；并且，所述步骤(2)的裂解时间为1-4小时。在上述制备方法中，所述步骤(3)具体包括：(3-a)使用乙醚沉淀所述多肽，然后用二甲基甲酰胺洗涤；(3-b)在加入占反应体系总体积10％的二甲基亚砜(DMSO)情况下，使沉淀得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备牛口蹄疫O型肽疫苗的多肽，其特征在于，所述多肽包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于制备牛口蹄疫O型肽疫苗的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，所述多肽的氨基酸序列中的两个半胱氨酸的巯基经氧化连接在一起形成二硫键，并且，所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸残基的羧基与氨基或者羧基与羟基之间反应形成共价连接。2.权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)以氨基树脂为起始原料，以由9-芴甲氧羰基保护的氨基酸为单体，按照所述氨基酸序列依次缩合接上氨基酸以合成所述多肽，每步缩合反应后用乙酰咪唑封闭未反应的氨基端；(2)合成完毕后加入裂解试剂，从而将所述多肽从氨基树脂上裂解下来；(3)使用乙醚沉淀所述多肽；(4)对所述多肽进行超滤纯化，然后进行无菌处理。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)包括以下步骤：(1-a)脱保护反应：将氨基树脂置于体积百分比为15-30％的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在20-28℃条件下反应25-40分钟，从而脱除氨基树脂上的9-芴甲氧羰基保护基团；(1-b)洗涤：氮气吹干，然后用N-甲基吡咯烷酮洗涤氨基树脂；(1-c)缩合反应：加入1-羟基苯丙三唑、二环己基碳二亚胺与由9-芴甲氧羰基保护的氨基酸，然后在20-28℃条件下反应0.5-2.5小时；(1-d)洗涤：氮气吹干，然后用N-甲基吡咯烷酮洗涤氨基树脂；(1-e)封闭反应：加入重量体积百分比为1.5-4％的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮溶液，在20-28℃条件下反应20-40分钟。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中裂解试剂的组分为体积比为85：8：6：1的三氟乙酸：三异丙基硅烷：苯酚：H2O。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的裂解时间为1-4小时。6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤(3)中还包括：(3-a)使用乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：巴利民，齐鹏，肖进，栗利芳，宋芳，董春娜，赵洪涛，郑应华，郑明举，张爱民，马爱荣，
申请(专利权)人：中国牧工商集团总公司，中牧实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11