透性化乳酸克鲁维酵母细胞乳糖酶的生产方法技术

一种乳糖酶的生产方法，先取氯仿１－３ｍｌ，无水乙醇５－８０ｍｌ，加水稀释成１００ｍｌ试剂；再取１ｇ乳酸克鲁维酵母细胞，加入３－２０ｍｌ试剂，在１５－４５℃下振荡１－１０ｍｉｎ，然后放入冰水浴中冷却至５℃以下，经离心并清洗２～３遍放入－２５℃冰柜中预冻，再经真空冷冻干燥，即为透性化细胞乳糖酶成品。该酶活力为１０８．７ＯＮＰＧ／ｍｇ，比细胞自溶所得粗酶液活力高约２３％；且成本价仅为商用酶制剂的１／４，还具有反应产物单一、无代谢副产物等特点。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术在食品加工
的应用，属于食品特别是乳制品加工所需酶的生产技术。乳糖酶(Lactase)，按照国际生化联合会酶学委员会的命名法，称为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactoside galacto-hydrolase，E.C.3.2.1.23)，是解决乳糖不耐症问题的关键。即可通过寻找外源性的乳糖酶将乳糖降解，开发低乳糖乳制品或直接供患者口服用于治疗乳糖不耐症。虽然人类乳糖酶缺乏现象比较普遍，但自然界中乳糖酶的分布还是比较丰富的，在很多植物、动物和微生物体内均可发现其存在。根据Shulkla报道，自然界中乳糖酶的分布情况如表1所示。表1自然界中的乳糖酶来源植物(Plants)梨(Peach)杏(Apricot)扁桃(Almond)开菲尔粒(Kefeir grains)野玫瑰花尖(Tips of wild roses)紫花苜蓿籽(Alfalfa seed)咖啡豆(Coffee berries)动物器官肠(Intestine)(Animal organs) 脑与皮肤组织(Brain and skintissue)酵母(Yeast) 乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces/Saccharomyces lachs)脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces/Saceharomyces fragilis)热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)细菌(Bacteria) 大肠杆菌(Escherichia coli)巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)乳酸链球菌(Streptococcus lactis)真菌(Fungi) 粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)臭曲霉(Aspergillus foetidus)黑曲霉(Aspergillus niger)黄曲霉(Aspergillus flavus)米曲霉(Aspergillus oryzae)海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)微小毛霉(Mucor pucillus)常见的能够产生乳糖酶的微生物及其乳糖酶的特性如表2所示。一般情况下，细菌乳糖酶的最适pH6.5～7.5，适合于牛奶(pH6.6)和鲜乳清(pH6.1)中乳糖的水解。除表2中所列的几种细菌来源的乳糖酶外，近年来，人们对其他细菌来源的乳糖酶也进行了不少研究。如M.V.Ramana Rao和S.M.Dutta(1981)对嗜热链球菌β-半乳糖苷酶进行了提纯并对其特性进行了研究，结果表明该酶的最适pH在6.6～7.0之间，最适温度为57℃，分子量约为6×105道尔顿；N.A.Greenberg和K.RMahoney(1982)对嗜热链球菌β-半乳糖苷酶的研究也得出了相似的结果；Norman A.Greenberg等(1985)专门就嗜热链球菌在牛乳和甜乳清中的热稳定性作了研究；Andrew P.Bakken等(1992)报道了固定化环状芽孢杆菌β-半乳糖苷酶对脱脂乳中的乳糖的水解作用的研究。表2 β-半乳糖苷酶产生菌及其酶特性 注nd.-未测酵母乳糖酶的最适pH6～7，亦适合于水解牛乳(pH6.6)和鲜乳清(pH6.1)中的乳糖。能够产生乳糖酶的酵母菌并不多，常见的除表2中的脆壁克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母外，还有马克斯克鲁维酵母和热带假丝酵母。它们都是乳糖酶较好的商业来源。对于后两种酵母所产的乳糖酶，Jose A.Goncalves等(1982)和Francisco J.Castillo等(1983)分别进行了研究，结果发现它们的性质基本与前两种酵母所产的乳糖酶相似。真菌乳糖酶的最适pH偏酸性，为pH2.5～4.5，适于酸性乳清中乳糖的水解。人们对真菌源的乳糖酶的研究主要集中于黑曲霉乳糖酶和米曲霉乳糖酶。霉菌来源的乳糖酶的耐热性要好于酵母乳糖酶，但其水解作用的最适pH与牛乳自然pH不相符，因而不适于生产乳糖水解乳制品。迄今为止，国际上公认的可以在食品工业中安全使用的乳糖酶主要是来自于乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、黑曲霉和米曲霉，人们虽然对其他微生物乳糖酶也进行了广泛的研究，但由于安全上的原因，尚不能放心地用于食品工业中。乳糖酶难以在工业生产中应用的一个重要的制约因素就是提取成本太高。微生物乳糖酶大多属胞内酶，需经多步分离纯化才能获取较高酶活力的乳糖酶制剂，而且在每步纯化操作过程中，都不可避免地导致酶蛋白部分变性失活，造成总活力的损失。利用活的微生物细胞水解乳糖，虽然成本较低，但由于底物必须通过细胞壁和细胞膜进入胞内后才能被水解，乳糖的水解速度就因此而大大降低，难以满足工业生产的需要。另外，活细胞对乳糖水解的同时，还会将水解产物葡萄糖和半乳糖进一步代谢产生CO2和乙醇以及细胞进行生命活动产生其它新陈代谢产物，这些都使得产品质量受到影响，甚至造成产品缺陷。国外最近兴起的利用渗透处理细胞技术生产透性化细胞乳糖酶的研究可望克服以上缺点。综合文献报道，渗透处理细胞生产透性化细胞乳糖酶多是利用毛地黄皂苷、乙醚、丙酮、乙醇、氯仿、羟苯甲酸甲酯、异丙醇、叔丁醇、甲苯、CTAB、十二烷基磺酸钠等有机溶剂或表面活性剂，在一定的温度和pH条件下，对细胞渗透一定时间，改变细胞壁和细胞膜的通透性，使细胞的乳糖酶表现活力大大增加，底物乳糖及水解产物可自由进出细胞。酵母源的乳糖酶非常适合于牛乳中乳糖的水解，因而对酵母细胞进行渗透处理生产透性化酵母细胞乳糖酶具有特殊重要的意义。M.S.Joshi等(1989)利用0.1％的毛地黄皂苷对脆壁酵母细胞进行渗透处理后，所得透性化细胞乳糖酶活力较原细胞可增加400～500倍，比利用甲苯对细胞自溶所得的粗酶液活力高25％，效果非常显著，但毛地黄皂苷却是一种价格昂贵的药品，用于工业化生产透性化细胞乳糖酶，成本仍嫌太高。而M.Decleire等(1987)、M.V.Flore等(1994)和M.I.G.Siso等(1992)所报道的用多种普通有机溶剂和热休克法对克鲁维酵母细胞进行渗透处理的结果表明，利用价格便宜的乙醇、丙酮、氯仿、甲苯等试剂同样可获得较好的渗透处理效果，为将这种技术用于工业化生产透性化细胞乳糖酶打下了基础。本专利技术的目的是提供一种科学的新型透性化细胞乳糖酶的生产方法，为工业化生产低乳糖乳制品提供一种高活力的、廉价的和安全的休止细胞乳糖酶制剂。本专利技术是这样实现的一种乳糖酶的生产方法，该生产方法为先取氯仿1-3ml，无水乙醇5-80ml，加水稀释成100ml试剂；再取1g乳酸克鲁维酵母细胞，加入3-20ml试剂，在15-45℃下振荡1-10min，然后放入冰水浴中迅速冷却至5℃以下，经离心并清洗2～3遍后放入-25℃冰柜中预冻，再经真空冷冻干燥，即为透性化细胞乳糖酶的成品。具体生产步骤为(1)试剂配制氯仿(分析纯)2ml，无水乙醇(分析纯)10ml，加水稀释到100ml(2)操作方法取1g乳酸克鲁维酵母细胞加入上述试剂15ml，在37℃下振荡5min，然后放入冰水浴中迅速本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乳糖酶的生产方法，其特征在于：先取氯仿１－３ｍｌ，无水乙醇５－８０ｍｌ，加水稀释成１００ｍｌ试剂；再取１ｇ乳酸克鲁维酵母细胞，加入３－２０ｍｌ试剂，在１５－４５℃下振荡１－１０ｍｉｎ，然后放入冰水浴中迅速冷却至５℃以下，经离心并清洗２～３遍后放入－２５℃冰柜中预冻，再经真空冷冻干燥，即为透性化细胞乳糖酶的成品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：骆承庠，陈铁涛，
申请(专利权)人：中国牧工商集团总公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]