一种有机-无机杂化整体柱及其制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于蛋白质和肽段分离的有机-无机杂化整体柱及其制备方法。所述的有机-无机杂化整体柱是以烷基三甲（乙）氧基硅烷类和胺基桥联三甲（乙）氧基硅烷类作为硅烷化前体，采用碱催化溶胶凝胶方法制备所得。基于胺基桥联三甲（乙）氧基硅烷，此材料具有以下优点：(1)骨架结构上的Si-C键可提高材料的机械强度及化学稳定性；(2)骨架结构上的胺基可抑制残留硅羟基的非特异性吸附，从而改善蛋白质和肽段分离的色谱峰型，提高峰容量；(3)胺基为弱带电的极性基团，可改善蛋白质和肽段分离的选择性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白质和肽段分离色谱固定相，具体地说是一种新型有机-无机杂化整体柱及其制备以及在蛋白质和肽段分离方面的应用。
技术介绍
蛋白质组学是后基因时代生命科学研究的核心内容之一。然而，生物样品中蛋白质及其酶解产物极其复杂，因此在检测之前通常需要对其进行分离，以降低样品的复杂程度。液相色谱具有分离效率高、重现性好等优点，是目前广泛使用的一种分离技术。其中色谱固定相是液相色谱的核心部件，主要包括填充柱和整体柱。由于整体柱具有传质速度快和反压低等优点，备受分离科学家的关注。按照材质的不同，目前整体柱主要分为：有机聚合物整体柱、硅胶整体柱和有机-无机杂化整体柱。有机聚合物整体柱制备简单、种类多样、pH适用范围宽，但是孔径分布不均匀，比表面积小，因此柱效较低。硅胶整体柱机械强度高，骨架分布均匀，比表面积较大，柱效较高，但制备重现性较差，不耐极端pH条件，并且硅羟基的非特异性吸附导致峰拖尾问题。有机-无机杂化整体柱结合了有机聚合物整体柱和有机-无机杂化整体柱的优点，具有制备简单、种类多样、比表面积较大、柱效较高等优点，因此应用越来越广泛；但是化学不稳定性及硅羟基的非特异性吸附问题仍亟待解决[1]。本专利技术针对这两个问题，发展了一种新型的有机-无机杂化整体柱，并用于蛋白质和肽段的高效分离。[1]Yu Liang,Lihua Zhang,Yukui Zhang,Analytical and bioanalytical chemistry,2013,405(7),2095-2106.
技术实现思路
本专利技术的目的是发展一种新型有机-无机杂化整体柱，以提高现有有机-无机杂化整体柱的物化性能和分离能力，并将其用于蛋白质和肽段分离。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：以烷基三甲（乙）氧基硅烷类和胺基桥联三甲（乙）氧基硅烷类作为硅烷化前体，以醇和水作为溶剂，以二元表面活性剂作为致孔剂，采用碱催化溶胶凝胶方法在毛细管中原位制备。具体步骤如下：(1)预聚溶液的配制：称量烷基三甲（乙）氧基硅烷类、胺基桥联三甲（乙）氧基硅烷类、二元表面活性剂、醇和水，混匀。其中烷基三甲（乙）氧基硅烷类和胺基桥联三甲（乙）氧基硅烷类的体积比例为1/3-1/1，两者总体积占烷基三甲（乙）氧基硅烷类、胺基桥联三甲（乙）氧基硅烷类、醇和水总体积的的15%-40%。二元表面活性剂包括阳离子表面活性剂（十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵或十八烷基三甲基溴化铵）和非离子型表面活性剂（P123或F127），两者的质量比为0.5-2，总质量占预聚溶液质量的10%-30%。醇（甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇）占烷基三甲（乙）氧基硅烷类、胺基桥联三甲（乙）氧基硅烷类、醇和水总体积的的45%-82%，水占烷基三甲（乙）氧基硅烷类、胺基桥联三甲（乙）氧基硅烷类、醇和水总体积的3%-15%。(2)原位溶胶凝胶反应：将预聚溶液迅速灌入预处理的毛细管中，密封，30-50℃反应6-24h。反应后依次用甲醇、水、80%ACN+0.1%TFA、水冲洗。(3)将制备的毛细管柱作为分离柱，采用液相色谱系统，对蛋白质样品进行分离。本专利技术具有如下优点：1.采用一步碱催化溶胶凝胶法原位制备有机-无机杂化整体柱，操作简单；2.骨架结构上的Si-C键可提高材料的机械强度及化学稳定性；3.骨架结构上的仲胺基可抑制残留硅羟基的非特异性吸附，从而改善蛋白质分离的色谱峰型，提高峰容量；4.仲胺基为弱带电的极性基团，可改善蛋白质和肽段分离的选择性。附图说明图1基于仲胺基桥联硅烷的有机-无机杂化整体柱的合成路线；图2采用制备的有机-无机杂化整体柱两次平行分离四种标准蛋白质混合物的色谱图；图3采用制备的有机-无机杂化整体柱分离E.coli提取物的色谱图；图4采用制备的有机-无机杂化整体柱分离五种标准肽段混合物的色谱图（三次平行分析）。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术提供的方法进行详述，但不以任何形式限制本发明。实施例1如图1所示制备有机-无机杂化整体柱。首先对石英毛细管(100μmi.d.)进行预处理：用1MHCl溶液冲洗2h，用水冲洗呈中性；通入4%HF(40%HF用水稀释10倍)，35℃反应3h；用1MNaOH溶液冲洗毛细管2h，用水冲洗呈中性；用甲醇冲洗，120℃氮气吹干备用。然后称取24mg十六烷基三甲基氯化铵和22mg环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物F127（质量比24：22）溶于200μL甲醇中，加入25μL正辛基三乙氧基硅烷和25μL双(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)胺（体积比1：1），最后加入20μL水，混匀，快速灌入预处理的石英毛细管(100μmi.d.)中，密封，40℃反应12h。所得的整体柱依次用甲醇、水、80%ACN+0.1%TFA和水冲洗。制备的整体材料经过水和酸性溶液冲洗后，仍然与毛细管壁紧密结合，无坍塌、收缩和皲裂现象。说明制备的整体柱机械强度和化学稳定性较好。实施例2将实施例1中制备的有机-无机杂化整体柱作为分离柱，采用纳升级液相色谱-紫外系统，用于标准蛋白质混合物的反相色谱分离。色谱分离条件如下：分离柱：100μmi.d.×23cm；样品：标准蛋白质混合物(RNase A、Cyto C、Lysozyme、BSA各0.2mg/mL)；进样0.1min；流速：1μL/min；流动相A：2%ACN+98%H2O+0.1%TFA；流动相B：98%ACN+2%H2O+0.1%TFA；梯度：0-5-10-30-40min，0%-0%-40%-80%-80%B；紫外检测波长214nm。如图2所示，四种标准蛋白质混合物达到了基线分离，且重现性较好，峰型对称，平均半峰宽为3.75s，峰容量达到377。实施例3将实施例1中制备的有机-无机杂化整体柱作为分离柱，采用纳升级液相色谱-紫外系统，用于E.coli复杂样品中蛋白质的反相色谱分离。色谱分离条件如下：分离柱：100μmi.d.×23cm；样品：E.coli蛋白质样品（含尿素），1.5mg/mL；进样0.33min；流速：1μL/min；流动相A：2%ACN+98%H2O+0.1%TFA；流动相B：98%ACN+2%H2O+0.1%TFA；梯度：0-10-30-70-90-100min，0%-0%-20%-40%-80%-80%B；紫外检测波长214nm。如图3所示，500ngE.coli蛋白质样品达到了高效分离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种有机‑无机杂化整体柱，其特征在于：是以烷基三甲（乙）氧基硅烷类和胺基桥联三甲（乙）氧基硅烷类作为硅烷化前体，采用碱催化溶胶凝胶方法制备所得；其中，胺基桥联三甲（乙）氧基硅烷类同时作为溶胶凝胶反应的碱性催化剂。

【技术特征摘要】
1.一种有机-无机杂化整体柱，其特征在于：
是以烷基三甲（乙）氧基硅烷类和胺基桥联三甲（乙）氧基硅烷类作为
硅烷化前体，采用碱催化溶胶凝胶方法制备所得；其中，胺基桥联三甲（乙）
氧基硅烷类同时作为溶胶凝胶反应的碱性催化剂。
2.一种权利要求1所述整体柱的制备方法，其特征在于：
由烷基三甲（乙）氧基硅烷类、胺基桥联三甲（乙）氧基硅烷类、表面
活性剂、醇和水组成的预聚溶液，通过碱催化溶胶凝胶方法在毛细管中原
位制备；其中，胺基桥联三甲（乙）氧基硅烷类同时作为溶胶凝胶反应的
碱性催化剂。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：
以烷基三甲（乙）氧基硅烷类和胺基桥联三甲（乙）氧基硅烷类作为硅
烷前体；
所述烷基三甲（乙）氧基硅烷类包括烷基三甲氧基硅烷类和烷基三乙氧
基硅烷类中的一种或二种以上；胺基桥联三甲（乙）氧基硅烷类包括双(3-
三甲氧基甲硅烷基丙基)胺和二(3-(甲氨基)丙基)三甲氧基硅烷中的一种
或二种；烷基三甲（乙）氧基硅烷类和胺基桥联三甲（乙）氧基硅烷类两
者的体积比例为1/3-1/1，两者总体积占烷基三甲（乙）氧基硅烷类、胺基
桥联三甲（乙）氧基硅烷类、醇和水总体积的15%-40%。
4.按照权利要求2或3所述的方法，其特征在于：
所述烷基三甲（乙）氧基硅烷类包括正辛基三乙氧基硅烷、十二烷基三
乙氧基硅烷、苯基三乙氧基硅烷、十八烷基三甲氧基硅烷、苯基三甲氧基
硅烷中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，梁玉，吴慈，朱旭东，杨开广，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21