本发明专利技术涉及一种BK通道的特异性配体的重组质粒及其重组表达方法，该配体质粒为SEQ ID NO:1所示的碱基序列。本发明专利技术提供了体外表达载体pGEX-4T-3的构建以及MarTX体外表达方法的技术参数。本发明专利技术所得到的短链蝎毒素MarTX在pGEX-4T-3系统中被成功表达，其分子量和生物活性与天然MarTX 几乎吻合；重组MarTX 可选择性地阻断BK通道（α+β4），部分抑制mKv1.3通道的电流，但对hKv4.2和hKv3.1a没有明显的调制效应。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种BK通道的特异性配体的重组质粒的重组表达方法。
技术介绍
在众多离子通道中，钾离子通道是分布最广泛、亚型最多、结构最复杂的一类离子 通道，几乎存在大多数的生物中。钾离子通道控制了广泛的生物功能，其对于动作电位在可 兴奋性细胞中的产生和传播有着关键性作用，其激活和失活特性与动作电位的发放模式有 着密切关系。钾离子通道的特异性配体在天然产物中的含量微乎其微，难以通过传统的分 离纯化手段获得；且由于其分子量小的限制，通过常规体外表达方式，也难以获得有活性的 多肽。 目前，虽然已有超过10种短链毒素从东亚短钳蝎（及ZiAw1S Karsch) 毒中被分离提取出来，然而无一被成功地体外表达，其中就包括BK通道的特异性配体 Martentoxin。Martentoxin (MarTX)是一种特异性作用于BK通道的短链肽毒素，由37个 氨基酸残基构成(分子量4060 Da)，隶属于a-KTX 16亚家族，亦被称为BmTX3B。因此，通过 体外表达途径获得天然产物中稀少的Martentoxin，对于充分地解析BK通道的受体位点， 及通道与配体相互作用的模式具有重要的推进作用。但仅通过常规的体外表达方法获得重 组Martentoxin (rMartentoxin)，其产量和活性均不高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服技术中存在的缺陷，提供一种采用分子生物手段针对性地 修改体外表达载体PGEX-4T-3,并优化体外表达方法，从而获得重组的rMarTX的方法，该方 法具有良好的产量和毒素活性。 本专利技术利用膜片钳检测了 rMarTX对4种钾通道的药理学效应，其对4种钾通道的 药理学效应和野生型几乎吻合。 曾有报告提示，重组毒素容易在诸如BL21及其衍生物BL21 (DE3)菌株等原核细 胞表达系统中形成包涵体，降低了其表达产物的活性和得率。在本研宄中，GST-rMarTX融 合蛋白始终溶于上清液中，并没有形成包涵体。这或许是由于融合蛋白本身性质与超声破 菌的实验条件决定的；冷冻干燥后对rMarTX的重折叠及HPLC的检测也保证了毒素的结构 准确和得率。经电生理记录验证，1 μ M的rMarTX可有效地抑制BK通道的电流，其IC5tl和 Hill系数与天然毒素十分相近。由此表明，经BL2KDE3)系统表达具有生物活性的rMarTX 的途径是可行的。 为了提高毒素的产量，除了 PGEX-4T-3载体外，我们还尝试了以下几种异源表达 系统（pET32a和pGEX-KG)。遗憾的是，这些系统的产率不及pGEX-4T-3 (表1 )，最后被放弃 米用。 表1各表达载体和大肠杆菌菌株rMarTX的得率为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案： 一种BK通道的特异性配体的重组表达方法，其特征在于该方法的具体步骤为： a. 基于MarTX的cDNA序列，涉及两对引物，MarTX-正向引物为： 5'-1'1^66八1'(：0'176640^4了464-3'，其中包含一个83111!11的酶切位点 ；]\&11^乂-反向引物 为：5 ' -CTTCCCGGGTTAATCAGTAGCAT-3 '，其中包含一个Sma I的酶切位点；构建载体质粒 pGEX-4T-3_martentoxin ; b. 根据设计PCR点突变的引物序列： 其正向引物为：5' -GATGACGATGACAAGITTGGACTCATAGACGTAAAATGTITTG-3'，其中包含小 肠激酶识别位点的DNA序列； 反向引物是凝血酶酶切位点的DNA序列，该序列为：5' -GGATCCACGCGGAACCAGATC-3'， 其中包含一个BamH I位点；以该pGEX-4T-3-martentoxin质粒为模板进行反向PCR，所得 产物经纯化回收得该.DNA回收产物；该反向PCR的反应体系为：pGEX-4T-3-martentoxin ?μL，正向引物 ?μL，反向引物 ?μL，2. 5mmol/L dNTPs 5μ1, IOXPCR buffer 5μ1, 25mmol/L MgCl2 2· 8μ1, 2· 5υ/μ1 KOD ?μL, ddH20 33. 2μ1 ; c. 将步骤b所得DNA纯化回收并且将其回收产物磷酸化，并与Τ4连接酶连接； d. 将步骤c所得产物转化Ε. coli/DH5a感受态细胞，得到了完整的表达质粒 pGEX-4T-3-MarTX ； e. 将步骤d所得表达质粒pGEX-4T-3-MarTX转化至大肠杆菌菌株中，以诱导毒素蛋白 的表达，在冰浴下超声破碎细胞，得裂解物； f. 将步骤e所得裂解物分离纯化，超滤管脱盐后，小肠激酶酶切并在室温孵育20 h， 得酶切产物； g. 将步骤f所得酶切产物经纯化后真空冷冻干燥，使用含有50 mM DTT的Tris-碱缓 冲液（pH 8.0)还原，得重组产物；该重组产物在包含I mM还原型谷胱甘肽（GSH)和0.1 mM 氧化型谷胱甘肽（GSSG)的0.05 M Tris-碱缓冲液（pH 8.0,其中有2 M盐酸胍)中重折叠， 得到BK通道的特异性配体的重组表达质粒。 该重组表达质粒的序列为SEQ ID NO: 1所示的碱基序列。 上述的步骤c中的DNA纯化回收的具体步骤为： ① 柱平衡步骤：向吸附柱CA2中，（吸附柱放入收集管中）加入500 PL平衡液BL， 12,000 rpm离心一分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中； ② 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分）放入干净的离心 管中，称取重量； ③ 向胶块中加入溶胶液PN:如凝胶重为O.lg，溶胶液为100 μL，依此类推；50°C水浴 放置10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解； ④ 将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中)，室温放置2分 钟，12, 000 rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中； ⑤ 向吸附柱CA2中加入700 μL漂洗液PW，12, 000 rpm离心60秒，倒掉收集管中 的废液，将吸附柱CA2放入收集管中； ⑥ 向吸附柱CA2中加入500 μL漂洗液PW，12, 000 rpm离心60秒，倒掉废液； ⑦ 将吸附柱CA2放回收集管中，12, 000 rpm离心2分钟，尽量除尽漂洗液。将吸附 柱CA2开盖至于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验； ⑧ 将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲 液EB，洗脱缓冲液EB应置于65-70° C水浴预热，室温放置2分钟；12, 000 rpm离心2 分钟收集DNA溶液。 上述的步骤d的转化E.coli/DH5a感受态细胞，得到了完整的表达质粒 pGEX-4T-3_MarTX的具体步骤为：10 PL连接产物与100 PL的感受态细胞温和混匀，插入 冰中放置30分钟；42°C热击90秒，然后快速插入冰中3分钟；加入400 μL的不含氨 苄青霉素的液体LB培养基，180 rpm，37°C培养45分钟；吸取100 PL涂板，37°C正置15 分钟，待完全吸收后，倒置培养14-16小时。挑取单菌落，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种BK通道的特异性配体的重组表达方法，其特征在于该方法的具体步骤为： a．基于MarTX的cDNA序列，涉及两对引物，MarTX‑正向引物为：5’‑TTCGGATCCTTTGGACTCATAGA‑3’，其中包含一个BamH I的酶切位点；MarTX‑反向引物为：5’‑CTTCCCGGGTTAATCAGTAGCAT‑3’，其中包含一个Sma I的酶切位点；构建载体质粒pGEX‑4T‑3‑martentoxin；b．根据设计PCR点突变的引物序列：其正向引物为：5’‑GATGACGATGACAAGTTTGGACTCATAGACGTAAAATGTTTTG‑3’，其中包含小肠激酶识别位点的DNA序列；反向引物是凝血酶酶切位点的DNA序列，该序列为：5’‑GGATCCACGCGGAACCAGATC‑3’，其中包含一个BamH I位点；以该pGEX‑4T‑3‑martentoxin质粒为模板进行反向PCR，所得产物经纯化回收得该.DNA 回收产物；该反向PCR的反应体系为：pGEX‑4T‑3‑martentoxin 1µl,正向引物 1µl,反向引物 1µl,2.5mmol/L dNTPs 5µl, 10XPCR buffer 5µl,25mmol/L MgCl2 2.8µl,2.5U/µl KOD 1µl,ddH2O 33.2µl；c.将步骤b所得DNA 纯化回收并且将其回收产物磷酸化，并与T4 连接酶连接；d.将步骤c所得产物转化E.coli/DH5α感受态细胞，得到了完整的表达质粒pGEX‑4T‑3‑MarTX；e. 将步骤d所得表达质粒pGEX‑4T‑3‑MarTX转化至大肠杆菌菌株中，以诱导毒素蛋白的表达，在冰浴下超声破碎细胞，得裂解物；f. 将步骤e所得裂解物分离纯化，超滤管脱盐后，小肠激酶酶切并在室温孵育20 h，得酶切产物；g. 将步骤f所得酶切产物经纯化后真空冷冻干燥，使用含有50 mM DTT的Tris‑碱缓冲液（pH 8.0）还原，得重组产物；该重组产物在包含1 mM还原型谷胱甘肽（GSH）和0.1 mM氧化型谷胱甘肽（GSSG）的0.05 M Tris‑碱缓冲液（pH 8.0，其中有2 M盐酸胍）中重折叠，得到BK通道的特异性配体的重组表达质粒。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吉永华，施健，陶杰，祝艳，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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