一种高纯度的微环DNA及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种高纯度的微环DNA及其制备方法和应用，所述制备方法包括：1)提供含有靶标序列的亲本质粒，所述亲本质粒具有特异性重组位点、骨架DNA的核苷酸序列和微环DNA的核苷酸序列；2)将所述亲本质粒转化到宿主细胞，经诱导后所述亲本质粒通过位点特异性重组作用产生微环DNA和含有靶标序列的骨架DNA；3)裂解宿主细胞，对质粒进行预纯化，得到混合质粒，所述混合质粒中包括微环DNA、含有靶标序列的亲本质粒和/或含有靶标序列的骨架DNA；4)采用三螺旋纯化法去除混合质粒中的含有靶标序列的亲本质粒和/或含有靶标序列的骨架DNA，得到高纯度的微环DNA。

【技术实现步骤摘要】
一种高纯度的微环DNA及其制备方法和应用
本专利技术涉及纯化用于基因治疗的表达载体，属于质粒载体的制备领域，具体涉及一种高纯度的微环DNA的制备方法及其应用。
技术介绍
在基因治疗中，一个高效、安全的载体将目的基因转移至真核细胞内表达是至关重要的。目前用于基因治疗的载体大致可分为两大类，即病毒载体和非病毒载体。在基因治疗载体中，重组腺病毒载体应用于临床占23.8％，逆转录病毒载体占20.7％，质粒载体占18.3％(MayrhoferP等,MethodsMolBiol,542:87-104(2009))。虽然病毒载体在体内的转染率高，但存在一些安全隐患，如病毒基因有整合到宿主基因组、免疫原性等潜在风险。相对于病毒载体，传统的质粒载体转染率低，临床用量达毫克级，但比病毒载体安全。然而，传统质粒载体中含有细菌复制序列、抗性基因、未甲基化的CpG基序和一些可能隐藏的表达信号(JechlingerW.等,ExpertRevVaccines,5(6):803-825(2006))，这些序列在质粒复制时是必需的，但在基因治疗中可能引起严重的生物的安全性问题。除此之外，抗性基因会通过水平基因转移的方式在宿主体内传播，如Pang等将不含真核启动子的质粒通过肌肉注射到兔体内，结果细菌基因表达导致兔发生严重免疫反应(PangAS.等,BiochemBiophysResCommun,202(3):1227－1234(1994))。另外，隐藏在真核表达信号上游的抗性基因还会导致哺乳动物细胞中基因的表达发生改变(HartikkaJ等,HumGeneTher,7(10):1205－1217(1996)；ValeraA等,HumGeneTher,5:449－456(1994))。此外，细菌序列的存在也会导致目的基因表达沉默。微环DNA是传统质粒在大肠杆菌中通过位点特异性重组得到的一种新颖的小环超螺旋表达框，其缺乏抗性标记基因、复制原点等细菌序列，增强了在临床应用上的安全性(ChenZY等,GeneTher,11(10):856－864(2004)；ChenZY等,Moleculartherapy,16(3):548－556(2008))。与病毒载体、质粒载体相比，无论是在体内还是体外进行基因表达，微环DNA减少了发生炎症和基因沉默的可能，表达周期更久，基因表达强度增强10-1000倍(MayrhoferP等,MethodsMolBiol,542:87-104(2009)；ChenZY等,GeneTher,11(10):856－864(2004)；US,897,380B2)。WHO[1],EMEA[2],FDA[3]指出的DNA投递的风险是外来DNA整合到受体基因组DNA上造成的插入性基因突变或者是抗生素基因表达的风险。如果投递的质粒DNA被线性化这种基因组整合的机会会明显提高。质粒载体有三种拓扑结构：超螺旋、环状、线性。这就是权威组织要求用于基因治疗的质粒含有高成分的超螺旋结构的原因(StenlerS等,HumVaccinImmunother,SafetyandefficacyofDNAvaccines:Plasmidsvs.minicircles,10(5),2014)。FDA建议超螺旋结构超过80％[3]。投递超螺旋结构的微环DNA的一个主要优势是它被认为没有基因组整合的风险。在最近的一个研究中，Stenleretal.研究了微环DNA和质粒DNA注射到老鼠体内的命运。让人印象深刻的是，质粒DNA被部分摧毁达不到FDA80％超螺旋结构的要求。但是微环DNA的命运要好得多，摧毁的微环DNA不到摧毁的质粒DNA的10％(StenlerS等,HumVaccinImmunother,SafetyandefficacyofDNAvaccines:Plasmidsvs.minicircles,10(5),2014)。在另一个研究中，环状的载体被认为比同样长度的线性的载体更能抵抗剪切力，而超螺旋结构更能抵抗剪切力使载体不被摧毁。这些结果表明微环DNA的另一个优势：抵抗剪切力使载体不被摧毁(CataneseDJ等,GeneTher,19(1):94-100(2012))。[1]WHO(2007).TheWHOExpertCommitteeonBiologicalStandardization56threport:Number941.Geneva:WorldHealthOrganization.[2]EMEA(2000).NoteforGuidanceontheQuality,PreclinicalandClinicalAspectsofGeneTransferMedicinalProducts.CPMP/BWP/3088/3099.[3]FDA(2007).Guidanceforindustry:considerationsforplasmidDNAvaccinesforinfectiousdiseaseindications.微环DNA的生产是通过传统质粒在大肠杆菌体内通过特异性重组位点的位点特异性重组得到的。位点特异性重组主要有phiC31(ΦC31)重组酶系统、parA重组酶系统、Cre重组酶系统(胡春生等,生物技术通讯,22(1):104-109(2011))，微环DNA的生产应用最多的是phiC31重组酶系统。phiC31重组酶来源于链霉菌噬菌体，是一种位点特异性的整合酶。它能有效地介导噬菌体基因组中attP位点与细菌宿主染色体上attB位点之间的重组反应。重组的特异位点称为att结合位点，细菌的att称作attB(attbacteria)；噬菌体的att称作attP(attphage)。phiC31重组酶系统在大肠杆菌中的理论重组效率为100％，在哺乳动物细胞中的重组率大于50％。phiC31重组酶识别的attB、attP位点的最小识别序列(attB如SEQIDNO:19所示，attP如SEQIDNO:20所示)。本申请专利技术人优选通过BP重组系统(phiC31系统)得到的微环DNA(微环DNA制备方法参照Kay,MA等,NatBiotechnol,28(12):1287-1289(2010)；US,897,380B2)。该技术与早期的微环DNA生产技术相比，有3个优点。第一，程序非常简单，与普通质粒的构建程序相比，在加入L-阿拉伯糖后，仅需要一个额外的温度变化和5小时的孵化程序；第二，与早期的微环DNA生产技术相比，产量增加3-5倍,微环DNA产品所含杂质减少了10倍；第三；生产微环DNA的成本大大降低，与标准质粒相似。由于基因载体技术是基因治疗的核心技术，具有很强的通用性，同一种载体可以携带任意的目的基因，都具有基本相同的生产工艺和质量标准。因此，该技术的发展为本项目的完成奠定了坚实的基础。卓越的功能，方便的生产技术，微环DNA已成为最佳的非病毒基因载体，被斯坦福和许多大学、公司用于基因治疗和其它研究，并有很多成功的临床前实验报告。美国SBI等多个公司，已构买微环DNA的使用权或销售有关产品。具体步骤包括：将含有亲本质粒的大肠杆菌基因工程菌Escherichiacoli(E.coli)ZYCY10P3S2T培养12-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)提供含有靶标序列的亲本质粒，所述含有靶标序列的亲本质粒具有特异性重组位点、骨架DNA的核苷酸序列和微环DNA的核苷酸序列；所述含有靶标序列的亲本质粒通过所述特异性重组位点的位点特异性重组产生微环DNA和含有靶标序列的骨架DNA；所述靶标序列为双链DNA，所述靶标序列含有与第三条单链相互作用形成三螺旋结构的核苷酸序列，所述微环DNA不含有与所述第三条单链相互作用形成三螺旋结构的核苷酸序列；2)将所述含有靶标序列的亲本质粒转化到宿主细胞，经诱导后所述含有靶标序列的亲本质粒通过特异性重组位点的位点特异性重组作用产生微环DNA和含有靶标序列的骨架DNA；3)裂解宿主细胞，对质粒进行预纯化处理，得到混合质粒，所述混合质粒中包括微环DNA、含有靶标序列的亲本质粒和/或含有靶标序列的骨架DNA；4)采用三螺旋纯化法去除所述混合质粒中的含有靶标序列的亲本质粒和/或含有靶标序列的骨架DNA，得到所述高纯度的微环DNA。

【技术特征摘要】
1.一种高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)提供含有靶标序列的亲本质粒，所述含有靶标序列的亲本质粒具有特异性重组位点、骨架DNA的核苷酸序列和微环DNA的核苷酸序列；所述含有靶标序列的亲本质粒通过所述特异性重组位点的位点特异性重组产生微环DNA和含有靶标序列的骨架DNA；所述靶标序列为双链DNA，所述靶标序列含有与第三条单链相互作用形成三螺旋结构的核苷酸序列，所述微环DNA不含有与所述第三条单链相互作用形成三螺旋结构的核苷酸序列；2)将所述含有靶标序列的亲本质粒转化到宿主细胞，经诱导后所述含有靶标序列的亲本质粒通过特异性重组位点的位点特异性重组作用产生微环DNA和含有靶标序列的骨架DNA；3)裂解宿主细胞，对质粒进行预纯化处理，得到混合质粒，所述混合质粒中包括微环DNA、含有靶标序列的亲本质粒和/或含有靶标序列的骨架DNA；4)采用三螺旋纯化法去除所述混合质粒中的含有靶标序列的亲本质粒和/或含有靶标序列的骨架DNA，得到所述高纯度的微环DNA。2.如权利要求1所述的高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述微环DNA具有目的基因。3.如权利要求1所述的高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述含有靶标序列的骨架DNA含有启动子，所述含有靶标序列的骨架DNA具有至少一个靶标序列，所述靶标序列位于所述启动子的上游和/或下游。4.如权利要求1所述的高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述特异性重组位点为phiC31特异性重组位点、parA特异性重组位点或Cre特异性重组位点。5.如权利要求1所述的高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述靶标序列中的任意一条DNA链包括如式I所示的核苷酸序列的至少一种：I：5’－(W)n－3’式中，所述W为碱基序列，在W中的嘧啶碱基数不超过8，所述n为所述靶标序列中任意一条DNA链的碱基总数，所述n为自然数，且6≤n≤60。6.如权利要求1所述的高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述第三条单链为单链DNA、单链RNA、单链PNA或单链DNG，所述第三条单链的5’端或3’端具有功能化修饰。7.如权利要求1所述的高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述第三条单链与所述靶标序列形成的三螺旋结构中，经典三联体的数目为t，所述t的取值范围为6≤t≤60，所述经典三联体为T＊AT三联体和+C＊GC三联体。8.如权利要求1所述的高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述第三条单链的序列选自SEQIDNO：10～SEQIDNO：18中的至少一种。9.如权利要求1所述的高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述宿主细胞具有经诱导后表达DNA内切酶的基因序列和经诱导后表达位点特异性重组酶的基因序列。10.如权利要求1所述的高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述含有靶标序列的骨架DNA具有表达位点特异性重组酶的核苷酸序列。11.如权利要求1所述的高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述三螺旋纯化法制备高纯度的微环DNA的步骤包括：a)将步骤(1)所述第三条单链的5’端或3’端进行修饰，得到修饰有接头基团的第三条单链；b)提供基质载体，...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯小虎，何成宜，陈志英，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44