一种茎瘤芥硫苷酶基因MYR1、茎瘤芥硫苷酶及其基因工程表达方法技术

本发明专利技术公开一种茎瘤芥硫苷酶基因MYR1、茎瘤芥硫苷酶及其基因工程表达方法，所述茎瘤芥硫苷酶基因MYR1核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述茎瘤芥硫苷酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；茎瘤芥硫苷酶的基因工程表达方法，提取茎瘤芥叶片中的总RNA，再采用RT-PCR法扩增硫苷酶基因MYR1，并构建表达载体，采用毕赤酵母表达系统进行表达，利用SalI酶切位点线性化载体，转化入毕赤酵母基因组，通过G418抗性，筛选出遗传霉素抗性转化子，采用甲醇诱导表达。经电泳分析，本发明专利技术重组子能进行表达，表达蛋白分子量为90KDa，测定纯化后蛋白的比活力，茎瘤芥硫苷酶的比活力约等于0.003U/μL。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于硫苷酶
，具体涉及一种茎瘤芥硫苷酶基因 MYR1、茎瘤芥硫苷 酶及其基因工程表达方法。
技术介绍
十字花科植物中有一种非常重要的防御酶即硫苷酶（Myrosinase)，也被称为介子 酶；硫苷酶能降解硫苷，降解产物中包含葡萄糖、硫酸盐、异硫代氰酸盐、硫氰酸盐等物质； 其中异硫代氰酸盐具有抗炎、预防癌症等作用；硫苷酶常常以同工酶的形式存在，这些同工 酶由于糖基化的程度不同导致其物理性质、化学性质不同。目前发现，硫苷酶至少有3种类 型的编码基因家族MA (Myrl，TGGl)、MB(Myr2, TGG2)、MC(Myr3, TGG3)，研宄表明MA基因家 族有4-5个基因，其编码的硫苷酶是可溶性二聚物。MB基因家族包括10-15基因，MC基因 家族由5个基因组成，MB和MC基因家族编码的硫苷酶是不可溶复合物。 目前国际上对硫苷酶的性质、提取方法做了很多研宄，对于硫苷酶的分离研宄首 先要提到Bjorkman等于1972年在白芥种子中提取了硫苷酶，并对其进行了纯化；紧接着 Ohtsuru等对硫苷酶的提纯方法和硫苷酶的性质进行了研宄；Xian Li等人从辣根当中也 提取到了硫苷酶，并将其分离出来；Bones等在1989年从油菜幼苗当中分离得到硫苷酶；然 而植物中的硫苷含量通常比较低，直接提取并不能大量获得硫苷酶。 为更好地研宄硫苷酶的性质，Chen and Barbara通过转基因技术将硫苷酶基因克 隆到酵母中表达出来，但表达的酶对酵母有毒，不能大量表达。目前国内学者主要从萝卜、 油菜、拟南芥、芥菜、西兰花中提取硫苷酶基因并构建表达载体进行表达；比如2008年肖海 燕等从油菜中提取硫苷酶基因后构建重组表达质粒并在大肠杆菌中诱导表达，得到90KDa 左右的蛋白条带；2010年梁锦锋等从西兰花中提取硫苷酶基因并在毕赤酵母中表达，得到 65KDa大小的蛋白条带；2012年张伟等人从甘蓝型油菜中提取硫苷酶基因并构建载体进行 表达；然而目前并未有从茎瘤芥中提取硫苷酶基因，并进行载体构建表达茎瘤芥硫苷酶的 相关研宄。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述不足，本专利技术的目的是提供一种茎瘤芥硫苷酶基因 MYRl。 本专利技术的另一目的是提供一种茎瘤芥硫苷酶。 本专利技术的再一个目的是提供上述茎瘤芥硫苷酶的基因工程表达方法。 实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种茎瘤芥硫苷酶基因 MYR1，其核苷 酸序列为SEQ ID NO. 1所示的序列。 一种茎瘤芥硫苷酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2所示的序列。 一种上述茎瘤芥硫苷酶的基因工程表达方法，包括如下步骤： 1) 取茎瘤芥叶片，提取总RNA ; 2) 以步骤1)提取的总RNA为模板，在PCR仪上通过反转录反应，合成第一链cDNA ; 3) 比较油菜和芥菜硫苷酶基因的核苷酸序列，设计一对正反向引物，所述引物为： 上引物1 : 5' _ GATCCGGTTCTGGCGAATTCGACGACGACGACAAGGATGAAGAAATCAC -3' ； 上引物2 : 5' - CGACGACGACAAGGATGAAGAAATCACATGTGAAGAAAATAACC-3' ； 下引物： 5' -GGCGAATTAATTCGCGGCCGCTTATTAAGCATCTGCGAAACGCTTCTTTTG -3' ； 4) 以步骤2)合成的第一链cDNA为模板，采用步骤3)所设计的引物，进行PCR反应， 扩增获得硫苷酶基因 MYRl的全长序列，所述硫苷酶基因 MYRl的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1 所示； 5) 提取载体PPIC9K-S质粒，并用EcoR I和NotI双酶切所述质粒； 6) 将步骤4)获得的硫苷酶基因 MYRl与步骤5)双酶切后的表达载体杂交，获得重组表 达载体 PPIC9K-S-MYR1 ; 7) 将步骤6)重组表达载体转化感受态细胞大肠杆菌DH10B，将转化后的细胞在含氨苄 抗性的LB平板上于37°C培养18小时，经PCR鉴定筛选阳性克隆菌并测序； 8) 将步骤7)测序正确的阳性克隆培养，并提取质粒，采用Sal I单酶切线性化处理，用 于毕赤酵母SMDl 168电转化； 9) 将Sal I单酶切线性化处理的重组表达载体pPIC9K-S-MYRl，电转化入毕赤酵母 SMD1168,涂布MD平板于30°C培养3-6天，并通过G418抗性，筛选得到遗传霉素抗性转化 子； 10) 挑取遗传霉素抗性转化子的单克隆至Yro培养基培养，在28°C条件下，以300 rpm/ h的转速振摇到0D600值为2-5之间，离心弃去上清液，向沉淀中加入BMMY液体培养基重悬 细胞；利用甲醇连续诱导表达，期间每24小时加甲醇至甲醇的终体积浓度为0. 5%以继续 诱导，诱导72 h后，利用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析鉴定重组蛋白的表达。 相比现有技术，本专利技术具有如下有益效果： 1、茎瘤芥硫苷酶在茎瘤芥中的含量非常少，在茎瘤芥中直接提取硫苷酶具有一定的难 度，且天然硫苷酶具有糖基化修饰作用，原核表达产物缺乏硫苷酶活性，因此糖基化修饰对 于硫苷酶酶活性有很大影响；本专利技术选择毕赤酵母为表达系统，在表达产物的加工、外分 泌、翻译、修饰以及糖基化等方面具有很大的优势，且毕赤酵母具有醇氧化酶AOXl基因启 动子，能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，非常有利于茎瘤芥硫苷酶的纯化。 2、本专利技术比较油菜、芥菜等植物硫苷酶基因的核苷酸序列，选取同源性较高的区 域，设计一对正反向引物，以茎瘤芥的第一链cDNA为模板，扩增茎瘤芥的硫苷酶基因 MYRl， 并构建重组表达载体口？扣91(-5-1^1?1，电转化入毕赤酵母51?1168，将硫苷酶基因1^1?1克隆 到毕赤酵母表达载体中，表达得到茎瘤芥硫苷酶，分子量为90 KDa。 3、本专利技术采用表达纯化后的茎瘤芥硫苷酶，以Sinigrin黑芥子苷为底物，测定重 组蛋白的活性，结果表明在45°C下，重组子所表达的蛋白能够水解硫苷，表现出硫苷酶的生 物活性，比活力约为〇· 〇3U/mL。 4、本专利技术重组子可大量表达茎瘤芥硫苷酶，相比于直接提取的方法，本专利技术更具 有经济价值，具有良好的市场推广前景。【附图说明】 图1为茎瘤芥叶总RNA电泳检测图； 图2为硫苷酶基因的RT-PCR扩增图； 图3为茎瘤芥硫苷酶基因序列BLASTX图； 图4为茎瘤芥硫苷酶氨基酸对比图； 图5为表达产物的SDS-PAGE图； 图6为纯化后的融合蛋白电泳图； 图7为活性测定后检测硫苷含量的HPLC图。【具体实施方式】 下面结合具体实施例和附图对本专利技术作进一步详细说明。 下述实施例中所米用的莖瘤芥（Brassica juncea (L. ) Czern. et Coss. var. tumida Tsen et Lee)为永安小叶，储藏期为3年，由重庆市涪陵绿原农业科技发展公司提 供；大肠杆菌DH10B，SMD1168工程菌，表达载体pPIC9K为NEB公司产品。 无 RNase H20、灭菌石蜡油、IXTAE缓冲液、IXTBE缓冲液、平衡缓冲液、洗脱缓冲 液、6 X loading buffer、GoldviewTM 核酸染料、RNase 抑制剂、dNT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种茎瘤芥硫苷酶基因MYR1，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张燕，王殿东，何秀丽，方平，刑立刚，王丽霞，姚启伦，
申请(专利权)人：长江师范学院，
类型：发明
国别省市：重庆;85