本发明专利技术涉及使用不需要钙黏着蛋白受体的毒素遏制昆虫对苏云金芽孢杆菌CRY毒素的抗性。本发明专利技术涉及用于获得编码具有3个缺少α-1螺旋的结构域的Cry毒素(也称为Cry毒素、Bt毒素或δ-内毒素)的DNA构建体的方法。所述DNA构建体被修饰以编码可杀死对相应的未修饰的Cry毒素具有抗性的昆虫的蛋白质。本发明专利技术涉及修饰的3-结构域Cry毒素的基因的DNA构建体和修饰的3-结构域Cry蛋白质，以及方法、含有所述构建体的分子载体和宿主细胞，以及产生修饰的3-结构域Cry毒素的重组方法。此外，本发明专利技术涉及含有修饰的3-结构域Cry毒素的制剂。昆虫对未修饰的Cry毒素的抗性是由于毒素与昆虫肠中的受体的结合降低。更具体地，本发明专利技术涉及修饰的3-结构域Cry毒素的表达、表达所述修饰的3-结构域Cry毒素的方法、具有表达所述修饰的3-结构域Cry毒素的构建体的转化微生物和转基因植物以及遏制害虫对未修饰的Cry毒素的抗性的方法。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】使用不需要钙黏着蛋白受体的毒素遏制昆虫对苏云金芽孢 杆菌CRY毒素的抗性 本申请是国际申请日为2007年6月8日的国际申请PCT/MX2007/000068进入中 国、申请号为200780053274. 5的题为"使用不需要钙黏着蛋白受体的毒素遏制昆虫对苏云 金芽孢杆菌CRY毒素的抗性"的专利技术专利申请的分案申请。
苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis，Bt)的Cry毒素由于它们在控制不同 栽培品种、林木中的虫害和在人类中传播疾病的昆虫的能力而具有重要价值。昆虫侵袭对 Bt毒素抗性的产生是继续成功使用此环境友好的杀虫剂的主要障碍。昆虫中对Cry毒素抗 性的主要机制包括Cry毒素与位于昆虫肠道的特异性受体的结合降低（Ferr6和VanRie， 2002)〇CrylA蛋白质是杀死一些重要鳞翅目昆虫的一组Bt毒素。在三种主要的棉花害虫 品系中，对 CrylA毒素的抗性与钙黏着蛋白的变化有关，钙黏着蛋白担当易感昆虫的肠中Cry毒素的 初级受体（primaryrec印tor)。钙黏着蛋白基因的突变产生对Bt毒素的"1型"抗性，这种 类型的抗性是不同昆虫中出现频率最高的抗性。这种类型的抗性呈现对至少一种CrylA毒 素的高水平抗性，其本质是隐性的，它降低至少一种CrylA毒素与抗性昆虫的膜的结合并 呈现非常小的对毒素CrylC的交叉抗性（Ferre和VanRie，2002)。令人感兴趣的是，小菜蛾 (gusanodorsodediamante，DBM)，Plutellaxylostella，攻击蔬菜诸如西兰花（br6coli) 和花椰菜的一种世界范围的害虫，呈现对CrylA毒素的" 1型"抗性，但是在这种情况下它并 不与钙黏着蛋白基因中的突变直接相关。DBM是田间选择的世界上唯一的Bt毒素抗性昆虫 (Tabashnik，2004)。与钙黏着蛋白的结合促进了结构域I的a-1螺旋的蛋白水解切割和 负责这些蛋白质的毒性的寡聚体前孔（pre-poro)的形成（G6mez等人，2002)。 在本专利技术中，证明了从缺少编码螺旋a-1的DNA的3-结构域Cry基因构建体 (constmcciones)产生的修饰的3-结构域Cry毒素，杀死对野生型（silvestres)3_结构域 Cry毒素（未修饰的Cry毒素）具有抗性的昆虫。 昆虫对未修饰的3-结构域Cry毒素的抗性的遗传基础与编码CrylA毒素初级受 体的钙黏着蛋白基因中的突变有关。在抗性昆虫中，所述初级受体被截短或不存在，所以 Cry毒素与肠细胞膜的结合被降低或不存在。因此，抗性昆虫对未修饰的3-结构域Cry毒 素不敏感。本专利技术中介绍的修饰的3-结构域Cry毒素通过不需要毒素与钙黏着蛋白受体 的结合来遏制抗性。修饰的3-结构域Cry毒素的毒性得到了对野生型CrylA毒素具有抗 性的两种昆虫品系的证明，其还在通过沉默钙黏着蛋白RNA诱导的对Cry毒素的具有降低 的易感性的昆虫中进行了测试。一个抗性昆虫品系通过钙黏着蛋白基因的遗传修饰呈现1 型抗性，而另一品系则呈现与钙黏着蛋白基因中的突变无关的1型抗性。 通过构建缺少a-1螺旋的基因产生的修饰的CrylA蛋白质诱导寡聚体前孔的体 外（invitro)形成而不需要结合钙黏着蛋白受体，也不需要含有Cry毒素结合位点的钙黏 着蛋白的片段或scFv格式的抗体（scFv73)(其模拟钙黏着蛋白受体中存在的Cry毒素结 合区）（G6mez等人，2002)。另一方面，未修饰的CrylA蛋白质需要scFv73抗体或妈黏着蛋 白的片段或钙黏着蛋白的存在以体外产生寡聚体前孔。 由于CrylA蛋白质作用模式与其他3-结构域Cry毒素的相似性、以及各种昆虫 对Cry毒素具有共同的抗性机制，本文描述的专利技术可具有非常广泛的应用。除了CrylA蛋 白质之外，还有许多其他为具有3-结构域结构的Cry毒素的Bt毒素，其中包括氨基酸序列 具有低相似性的蛋白质（deMaagd等人2001)。已报告不同的3-结构域Cry毒素（CrylA、 CrylB、CrylC、CrylD、CrvlE、CrvlF、Cry3A、Cry3B、Cry3C、Cry4A、Cry4B和Cryl1)形成与对 CrylAb毒素观察到的那些相似的寡聚体结构，并且所述结构插入靶幼虫肠细胞的膜形成离 子孔。这表明3-结构域Cry蛋白质具有相似的作用机制（G6mez等人，2002 ;Rausell等人， 2004a;Rausell等人，2004b;Herrero，S.等人，2004 ;Mufi〇Z._Garav等人，2006)。此外，昆 虫中对CrylA毒素最常见的抗性机制包括初级钙黏着蛋白受体的改变。这些改变避免了通 常由Cry毒素与钙黏着蛋白受体的相互作用介导的寡聚体前孔结构的形成。因此，我们预 测对未修饰的3-结构域Cry毒素具有抗性的不同昆虫可能对相应的修饰的3-结构域Cry 毒素敏感，其中编码a-1螺旋的片段已被除去（revealed)。由本文描述的基因构建体产生 的修饰的3-结构域Cry毒素可作为局部施用的杀虫剂（例如，作为喷雾杀虫剂）、作为转基 因微生物、或作为转基因植物呈现于昆虫群体。
技术介绍
苏云金芽孢杆菌（Bt)是属于赌状芽孢杆菌（Bacilluscereus)组的细菌 (Helgason等人2000)。与蜡状芽孢杆菌组的其他成员不同，Bt产生主要由称为Cry毒素、 Bt毒素或S-内毒素的杀虫剂蛋白质构成的伴胞晶体。Bt毒素对一些特定的昆虫有毒性，而对人类、脊椎动物和植物无毒。它们还是完全 生物可降解的。因此，Bt毒素对控制害虫是安全和有效的。这些毒素的应用包括：1)控制 林木的落叶侵袭，2)控制蚊和黑蝇，它们是人类疾病的载体，3)使用含有Bt毒素的杀虫剂 制剂或表达它们的微生物控制农业侵袭，和4)通过使用产生Bt毒素的转基因植物控制农 业侵袭。 根据Cry蛋白质的同源性，它们可划分为几个组。含有最大数量的Cry毒素变 体的组是3-结构域Cry蛋白质组。具有Cry毒素同源性的其他组包括与球形芽孢杆菌 (Bacillussphaericus)产生的Bin和Mtx毒素相似的Cry毒素（Crickmore等人，1998 ; Crickmore等人，2002)。 截至目前，已分离了大量Bt株系，找到了对鳞翅目、双翅目或鞘翅目昆虫有活性 的毒素（Schn印f等人，1998)。Cry毒素杀死昆虫，因为它们在幼虫的肠表皮细胞的膜上形 成溶孔。 3-结构域Cry毒素的结构。3-结构域Cry毒素家族的成员是由通过简单的接头 (conectores)连接的三个结构域形成的球形蛋白质。已报道了以CrylAa蛋白酶（鳞翅类特 异的）、Cry3A、Cry3B(鞘翅类特异的）、Cry4Aa和Cry4Ba(双翅类特异的）和Cry2Aa原毒素 (protoxin)(双翅类和鳞翅类特异的）作用的毒素的三维结构（Grouchulski等人，1995 ; Li等人，1991;Galistki等人，2001;Morse等人，2001;Boomserm等人，2005;Boomserm等 人，2006)。这些毒素中的一些毒素之间的序列同一性是低的。例如，Cry2Aa和本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的DNA片段，其由编码修饰的3‑结构域Cry1C亚家族毒素或Cry2A亚家族毒素的编码区组成，其中，所编码的修饰的3‑结构域Cry1C毒素或Cry2A毒素缺少α‑1螺旋但保持α‑2螺旋并因此能够杀死合格的抗性昆虫、遏制它们对未修饰的Cry1C亚家族毒素或Cry2A亚家族毒素的抗性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：L帕多罗佩斯，EB塔巴什尼克，M索维伦查韦斯，MA布拉沃德拉帕拉，
申请(专利权)人：墨西哥国立大学，亚利桑那大学评议会，
类型：发明
国别省市：墨西哥;MX
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