本发明专利技术涉及农业害虫，尤其是对农业生产危害严重的鳞翅目害虫的材料和方法，公开了一种从苏云金杆芽胞杆菌野生菌株BtHS66中分离克隆得到一个新型营养期杀虫蛋白基因vip3-like，该基因编码毒素蛋白由942个氨基酸残基组成，其与现有公开的蛋白质序列同源性不超过30%。新型Vip3-like蛋白对鳞翅目昆虫小菜蛾表现出高效的杀虫活性，新型vip3-like基因可以用于构建工程菌株或者培育转基因作物，不仅可以拓宽杀虫谱，还可以延缓害虫对现在广泛应用的Cry1和Cry2蛋白产生抗性。
【技术实现步骤摘要】
杀鳞翅目昆虫的新型viP3-like基因及其应用
在本专利技术属生物防治
，亦属于微生物基因工程
，具体涉及一种来自苏云金芽孢杆菌的新型营养期杀虫蛋白基因vip3-like的鉴定和克隆，涉及vip3~like基因在异源宿主细胞(工程菌)中的诱导表达，涉及Vip-1ike蛋白纯化和对鳞翅目昆虫杀虫活性的测定，以及该毒素蛋白在农业害虫生物防治领域的应用。
技术介绍
在苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是迄今为止最安全和应用最为广泛杀虫细菌。百年来的应用和研究表明，Bt杀虫的主要活性物质杀虫晶体蛋白对各种昆虫、线虫、原生动物和癌细胞有生物活性(Schn印f E., Crickmore N., Rie J.V.,Lereclus D., Baum J., Feitelson J., Zeigler D.R., and Dean D.H., 1998，Bacillusthuringiensis and its pesticidal crystal proteins, Microbiol.Mo 1.Biol.Rev.,62: 3: 775-806)。近年来，编码杀虫晶体蛋白的基因已经成功转入少数重要的农作物中而植物自身能够持续产生抗虫蛋白防治农业害虫，如转Si基因抗虫棉，在美国和中国等国家获得了大面积的种植，获得了良好的经济、环境和社会效益。在我国转价杀虫基因抗虫棉曾经力挽狂澜，挽救了棉花种植业。但正如多年使用同一种农药控制害虫会产生抗药性，长期大面积种植同一种抗虫转基因作物也可能导致害虫产生相应的抗性。目前抗虫转基因作物的抗虫基因主要是crylAb、cryIAc, cry2A及其同源基因，大量研究表明CrylAc、CrylFa和CrylJa等蛋白结合相同或相似的受体蛋白，容易产生交互抗性。CryIA和Cry2A蛋白不竞争同一受体蛋白，研究表明它们也可能因为抗性机制复杂性而产生交互抗性(Hernandez CS, Ferre J, Common receptorfor Bacillus thuringiensis toxins CrylAcj CrylFaj and CrylJa in Helicoverpaarmigera， Helicoverpa zea， and Spodoptera exigua.Appl Environ Microbiol 71(9):5627-5629, 2005;Jurat-Fuentes JLj Gould FLj Adang MJj Dual resistance toBacillus thuringiensis CrylAc and Cry2Aa toxins in Heliothis virescens suggestsmultiple mechanisms of resistance.Appl Environ Microbiol 69 (10):5898-5906，2003)。当前，商业化抗虫转基因作物绝大多数利用CirJA和基因，农业害虫对Cit杀虫蛋白抗性风险已经严重威胁转基因作物的安全和推广应用。为了解决目前大量单一使用CrylA和Cry2A等同源性杀虫蛋白带来的抗性风险,抗虫作物育种亟需开发与Cry蛋白基因有着不同杀虫机制的新型杀虫基因。 Vip蛋白在Bt营养期生长阶段开始分泌，它们不形成蛋白晶体，和蛋白晶体在进化上没有同源性。Vip的杀虫活性很高，达到了纳克级水平，为一类新型杀虫蛋白，被认为是第二代生物杀虫剂。最早在价菌株中发现的Vip是Estruch等(1996)发现的Vip3Aa和Vip3Ab。Vip在细菌的营养期生长阶段就开始分泌，但不形成蛋白晶体，这一特性与杀虫晶体蛋白在芽孢形成的同时伴孢产生完全不同(Estruch JJ, Warren Gff, Mullins MA,Nye GJ, Craig JA, andKoziel MG, 1996, Vip3A, a novel Bacillus thuringiensisvegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities againstlepidopteran insects, Proc Natl Acad Sci USA, 93 (11):5389-5394.)? Vip 与 Cry蛋白相比，Vip的杀虫谱更广，对某些农业害虫的活性更强。Vipl和Vip2共同作用，对鞘翅目萤叶甲科昆虫具有纳克级特异性杀虫活性，Vip3A不仅对鳞翅目昆虫具有广谱杀虫活性，而且对一些抗沒?杀虫晶体蛋白的昆虫，如小地老虎(blackcutworm, BCff)有特效。生测结果表明:Vip3Aa对BCW的毒性要比CrylAc高260倍，也达到了纳克级水平(陈建武等，2002)。基于Vip在农作物虫害防治和抗性控制管理中的重要意义，各国科学家争相发展各种方法发掘基因资源。Estruch等在1996年利用分子杂交的方法发现了 vip3A基因，检测率为15%。1999年，Rice利用PCR技术对^>24基因的存在进行检测，在对125株Si菌株进行检测后发现其中29株含有基因，检测率上升到23%。至今，已经有100多个基因被鉴定分离出来，1998年Crickmore等提出以编码Vip蛋白质氨基酸序列的同源性作为分类标准对Vip进行分类(Crickmore et al, 1998),并将目前已经克隆的基因在第一分类上分为 4 类:和 (Crickmore N, ZeiglerDR, Feitelson J, Schnepf E, Van Rie J, Lereclus D, Baum J, and Dean DH, 1998,Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystalproteins, Microbiol Mol Biol Rev, 62(3):807-813.；http://www.lifesc1.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/价/index, html)。Vip3蛋白对多种夜蛾科害虫，尤其是小地老虎有很高杀虫活性，而且Vip蛋白与Cry蛋白共同作用还能表现出协同效应，对一些可能对杀虫晶体蛋白产生抗性的害虫具有高效的毒杀作用(蔡启良，刘子铎，孙明，喻子牛，苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白Vip与Cry蛋白的协同作用.微生物学通报(05):43-48, 2003)。最为重要的是Vip蛋白杀虫机制不同于Cry蛋白，Vip蛋白和Cry蛋白之间难以产生交互抗性，因此转vip基因植物研究受到了科学家的青睐，并已有不少成功的报道和专利(Zhu C，Ruan L, PengD, Yu Z, Sun M, Vegetative insecticidal protein enhancing the toxicity ofBacillus thuringiensis subsp kurstaki against Spodoptera exigua.Le本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种苏云金芽胞杆菌新型vip3‑like杀虫基因序列，具有如SQE NO 1所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种苏云金芽胞杆菌新型杀虫基因序列，具有如SQE NO I所示的核苷酸序列。2.权利要求1所述的vip3-like基因序列，包含了该基因序列的部分序列或同源序列。3.—种对鳞翅目昆虫有杀虫活性的蛋白质的氨基酸序列，其特征是由权利要求1的基因序列所编码，具有如SQE NO 2所不的氣基酸序列。4.权利要求3所述的蛋白质的氨基酸序列，包含了该蛋白质的部分氨基酸序列或同...
【专利技术属性】
技术研发人员：张文飞，王锐萍，吴仲琦，钤江朝，
申请(专利权)人：海南师范大学，
类型：发明
国别省市：海南;66
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。